光遺伝学のような光学的方法は、細胞分子信号の精密な変調を提供することができる。我々のプロトコルは、フェムト秒レーザー刺激による細胞信号分子の経口光学操作を実証した。当社のフェムト秒レーザーを共焦点顕微鏡に結合することで、当社の技術は、フェムト秒レーザー刺激による単細胞または細胞内レベルの操作と、共焦点顕微鏡によるリアルタイムの分子動的モニタリングを提供することができます。
この方法は、フェムト秒レーザーを適切な方法でシステムに結合することにより、任意の蛍光顕微鏡システムに適用することができます。初めて当社の方法を試している人のために、レーザー施設の別の指示に従うか、ラボフェムト秒レーザー源を操作する際に専門家からの指導を求めてください。まず、フェムト秒レーザーと共焦点顕微鏡をオンにします。
反射ミラーを使用して、メカニカルシャッターを通してフェムト秒レーザービームを導きます。次に、一対のレンズからなるリレー望遠鏡をセットし、透過ビーム幅を広げる。これは、目的の背面開口と一致する必要があります。
次に、反射ミラーを操縦して、拡大されたビームを顕微鏡に位置合わせします。ここで指摘した2つの反射ミラーを調整して、フェムト秒レーザーの焦点を視野の中心に合わせます。最後に、付属のテキスト プロトコルに記載されているとおりに、レーザーを測定および調整します。
標準的な技術を用いた培養ヘラ細胞。実験を行う準備ができたら、付属のテキストプロトコルに記載されているようにERK2-GFPで細胞をトランスフェクトします。次に、レーザー走査型共焦点顕微鏡とフェムト秒レーザーをオンにします。
レーザーのシャッターが閉じられていることを確認します。次に、顕微鏡ソフトを開きます。励起レーザーを488ナノメートルに設定し、その電力レベルを0.1ミリワットに設定します。
イメージングサイズを512 x 512ピクセルに設定し、各ピクセルの間隔時間を2.4マイクロ秒に設定します。次に、2つのフレーム間の間隔を6秒に設定し、細胞への写真の漂白と写真の損傷を最小限に抑えます。また、イメージングフレームの合計を約300フレームに設定し、個々の実験で約30分間の連続顕微鏡検査を行います。
インキュベーターからERK2-GFPにトランスフェクトしたヘラ細胞を含む皿を取り出し、その皿を顕微鏡のステージに置きます。ソフトウェアでは、高速スキャンモードを開始し、細胞の透明な蛍光画像を取得する目的を調整します。次に、高速スキャンを停止し、CCDカメラを使用して明視野イメージングモードに切り替えます。
シャッターを開き、リレー望遠鏡の2つのレンズ間の距離を調整して、フェムト秒レーザーフォーカスの直径が約2ミクロンになるようにします。次に、シャッターを閉じて調整を完了します。フェムト秒レーザーのパワーを810ナノメートルのレーザーで15~40ミリワット、1040ナノメートルレーザーの場合は20~60ミリワットに設定します。
次に、シャッターの開封時間を05秒に設定します。高速スキャンモードを使用して、ERK2-GFPを強く発現するターゲットセルを選択します。見つかったら、選択したターゲットセルのサイトゾル領域を局所化し、明視野イメージングの下で視野の中心になるようにステージを移動します。
中央に配置したら、開始ボタンをクリックして連続イメージングを開始します。事前定義されたタイムスロットでシャッターを開き、フェムト秒レーザー刺激をターゲットセルに送ります。イメージングプロセスが完了したら、イメージングデータを保存してさらなる分析を行います。
フェムト秒レーザーのパワーを15~40ミリワット、810ナノメートル、標本で20~60ミリワット、1040ナノメートルに設定します。次いで、インキュベーターからERK2-GFPにトランスフェクトした細胞を含む皿を取り出し、顕微鏡ステージに置きます。高速スキャンモードを使用して、ERK2-GFPを十分に発現するターゲットセルを選択します。
次に、共焦点イメージングプロセスを設定し、撮像プロセスで刺激フレームとして特殊な走査フレームを定義します。刺激フレームのパラメータを定義します。標的細胞の核に近いサイトゾル領域に2~3個ずつ3平方ミクロンの走査領域を設定する。
スキャン時間の合計を 0.1 秒から 0.2 秒に設定します。2つのフレーム間の間隔を6秒に設定し、総イメージングフレームを約300フレームに設定して、約30分の連続顕微鏡を提供します。さらなるデータ分析のためにイメージングデータを保存します。
フェムト秒レーザーのシャッターを、レーザースキャンが刺激フレーム内に落ちるときにのみ開いている事前定義された写真刺激領域に従って共焦点スキャンのシャッターと同期させる。開始ボタンをクリックして、連続顕微鏡イメージングプロセスを開始します。ミトコンドリア形態学的ダイナミクスを観察するために、ミトコンドリアを蛍光的に示すミトコンドリアを示すミトグルドとヘラ細胞をトランスフェクトし、ミトフラッシュを観察するミトcpYFPを有する塩基を示す。
トランスフェクションの後、フェムト秒レーザーをオンにして、シャッターが閉じられていることを確認します。次に、レーザー走査型共焦点顕微鏡をオンにします。励起レーザーを488ナノメートルに設定します。
次に、488ナノメートルレーザーの電力レベルを0.1ミリワットに設定します。さらに、イメージングサイズを512 x 512ピクセルに、各フレームの総イメージング時間を2.2秒に設定します。次に、2つのフレーム間の間隔をゼロ秒に、総イメージングフレームを200フレームに設定し、個々の実験で約440秒間の連続顕微鏡検査を提供する。
ミトGFPまたはミトコンドリアでトランスフェクトされた細胞を含む皿をインキュベーターから円形に転動した黄色の蛍光タンパク質をインキュベーターから取り出し、その皿を顕微鏡のステージに置きます。フェムト秒レーザーの状態を確認して、フェムト秒レーザーの焦点が視野の中央に位置していることを確認します。次に、蛍光イメージングウィンドウの中心に基準矢印を設定し、焦点の位置を示す。
次に、フェムト秒レーザーのパワーを5~30ミリワットに設定し、レーザーは810ナノメートル、10~40ミリワットのレーザーは1040ナノメートルに設定します。シャッターの開始時間を 05 ~ 0.1 秒に設定します。速いスキャンモードを使用して、ミトGFPまたはミトコンドリア標的の円形に透過した黄色の蛍光タンパク質を良好に発現している標的細胞を選択します。
実験対象として標的細胞内のミトコンドリアを無作為に選択する。次に、顕微鏡ステージを移動し、基準矢印で示すように高速走査モードにより視野の中心にあるターゲットミトコンドリア管状構造を局部化する。開始ボタンをクリックして、連続イメージングを開始します。
最後に、事前に定義された任意の時間にシャッターを開き、フェムト秒レーザー刺激をターゲットミトコンドリア管状構造に送り込みます。イメージングプロセスが完了するまで待ってから、さらにデータ分析のためにイメージングデータを保存します。このプロトコルで提示された方法を使用して、ERK2はフェムト秒レーザーの短いフラッシュで処理された後、核に移入する。
ERK2-GFP蛍光は、フェムト秒レーザー刺激の数分後に最大に達する。ERK2分子は核内の下流の基質を活性化した後に脱リン酸化され、次いで、ERK2は核GFP蛍光の減少によって示される細胞質に戻ってくる。ERK2は、複数回の写真刺激によって複数回活性化することができる。
したがって、複数の刺激間の間隔時間を制御することによってERK2信号パターンを精密に操作することができる。さらに、ERK2は、刺激された細胞の周りの隣接する細胞で時折活性化され得る。この観察は、フェムト秒レーザーで処理された細胞によっていくつかの拡散性分子が放出され、隣接する細胞においてERK2を活性化することを示している。
ERK2下流タンパク質eIF4Eのリン酸化は、免疫蛍光顕微鏡法により個別化して確認することができる。この結果は、フェムト秒レーザー刺激がERKシグナル伝達経路を正常に活性化できることを示している。ミトコンドリア酸化フラッシュまたはミトフラッシュは、複雑な分子動力学から根を張るミトコンドリアの酸化バーストである。
この写真刺激スキームを実装すると、有糸引き起こしが成功しました。この写真刺激はまた、ミトコンドリア形態の断片化と回復、ミトコンドリア膜電位の振動を含むミトコンドリア分子動力学の品種を示しています。写真活性化ミトフラッシュと同様に、これらのミトコンドリアイベントは、異なる電力強度で異なる性能を有する。
最も重要なことは、フェムト秒レーザーの焦点、サイズ、精度が細胞内の刺激の特性であることを確認することです。近赤外フェムト秒レーザーは、ユーザーに危険である可能性があります。このプロトコルに従うときは、適切な保護を着用し、光テーブルからレーザーが拡散するのを防ぎます。
