Métodos ópticos, como a optogenética, podem fornecer a modulação precisa de sinais moleculares celulares. Nosso protocolo demonstrou uma manipulação óptica oral de sinais moleculares de sinal celular por estimulação a laser femtosegundo. Ao acoplar nosso laser femtosegundo em um microscópio confocal, nossa técnica pode fornecer operação de nível único ou subcelular por estimulação a laser femtosegundo e o monitoramento dinâmico molecular em tempo real por microscopia confocal.
Este método pode ser aplicado a qualquer sistema de microscopia fluorescente acoplado um laser femtosegundo no sistema da maneira adequada. Para quem está testinge nosso método pela primeira vez, siga as instruções separadas da instalação de laser ou busque orientação dos profissionais ao operar uma fonte de laser femtosegundo de laboratório. Para começar, ligue o laser femtosegundo e o microscópio confocal.
Use espelhos reflexivos para direcionar o feixe laser femtosegundo através de um obturador mecânico. Em seguida, defina um telescópio de relé composto por um par de lentes para expandir a largura do feixe de transmissão. Isso deve ser consistente com a abertura traseira do objetivo.
Agora, direva os espelhos reflexivos para alinhar o feixe expandido ao microscópio. Ajuste os dois espelhos reflexivos, apontados aqui, para ajustar o foco do laser femtosegundo ao centro do campo de visão. Finalmente, meça e sintonize os lasers conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.
Cultura Hela células usando técnicas padrão. Quando estiver pronto para realizar o experimento, transfete as células com ERK2-GFP conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, ligue o microscópio confocal de varredura a laser e o laser femtosegundo.
Certifique-se de que o obturador do laser está fechado. Então, abra o software do microscópio. Defina o laser de excitação em 488 nanômetros, e coloque seu nível de potência em 0,1 miliwatts.
Defina o tamanho da imagem como 512 por 512 pixels, e o tempo de intervalo de cada pixel como 2,4 microssegundos. Em seguida, defina o tempo de intervalo entre dois quadros em seis segundos para minimizar o branqueamento da foto e danos fotográficos às células. Além disso, defina os quadros totais de imagem em cerca de 300 quadros para fornecer cerca de 30 minutos de microscopia contínua em um experimento individual.
Pegue o prato contendo as células Hela transfeinadas com ERK2-GFP da incubadora, e coloque o prato no estágio do microscópio. No software, inicie o modo de digitalização rápida e sintonize o objetivo de adquirir imagens fluorescentes claras das células. Em seguida, pare de digitalizar rapidamente e mude para o modo de imagem de campo brilhante usando a câmera CCD.
Abra o obturador e ajuste a distância entre as duas lentes do telescópio de relé para garantir que o diâmetro do foco do laser femtosegundo seja de cerca de dois mícrons. Em seguida, feche o obturador para completar o ajuste. Defina a potência do laser femtosegundo em 15 a 40 miliwatts para um laser de 810 nanômetros, ou um laser de 20 a 60 milímetros para um laser de 1040 nanômetros.
Em seguida, defina o tempo de abertura do obturador em 05 a 0,2 segundos. Use o modo de varredura rápida para selecionar uma célula alvo que esteja expressando fortemente o ERK2-GFP. Uma vez encontrado, mova o estágio para localizar a área de citosol da célula alvo selecionada para que ela esteja no centro do campo de visão quando sob imagens de campo brilhante.
Uma vez centrado, clique no botão iniciar para iniciar a imagem contínua. Abra o obturador em qualquer slot de tempo predefinido para fornecer a estimulação a laser femtosegundo na célula alvo. Quando o processo de imagem estiver concluído, salve os dados de imagem para análise suplementar.
Defina a potência do laser femtosegundo em 15 a 40 miliwatts e 810 nanômetros e 20 a 60 miliwatts e 1040 nanômetros no espécime. Em seguida, pegue o prato contendo células transfeinadas com ERK2-GFP da incubadora e coloque-o no estágio do microscópio. Use o modo de varredura rápida para selecionar a célula alvo bem expressando ERK2-GFP.
Em seguida, defina o processo de imagem confocal e defina um quadro especial de varredura como o quadro de estimulação no processo de imagem. Defina o parâmetro da estrutura de estimulação. Defina uma região de varredura de dois por dois a três por três mícrons quadrados na área de citosol perto do núcleo na célula alvo.
Defina o tempo total de varredura em 0,1 a 0,2 segundos. Defina o intervalo entre dois quadros em seis segundos e defina os quadros totais de imagem em cerca de 300 quadros para fornecer cerca de 30 minutos de microscopia contínua. Salve os dados de imagem para análise de dados posteriores.
Sincronizar o obturador do laser femtosegundo com o da varredura confocal de acordo com a área de estimulação fotográfica predefinida que só é aberta quando o escaneamento a laser cai na estrutura de estimulação. Clique no botão iniciar para iniciar o processo contínuo de imagem de microscopia. Para observar a dinâmica morfológica mitocondrial, as células Hela transfectas com Mito-GFP indicam fluorescentemente as mitocôndrias, ou uma base com mito-cpYFP para observar mitoflashes.
Após a transfecção, ligue o laser femtosegundo e certifique-se de que o obturador esteja fechado. Em seguida, ligue o microscópio confocal de varredura a laser. Coloque o laser de excitação em 488 nanômetros.
Em seguida, defina o nível de potência do laser de 488 nanômetros em 0,1 miliwatt. Além disso, defina o tamanho da imagem para 512 por 512 pixels e o tempo total de imagem de cada quadro para 2,2 segundos. Em seguida, defina o tempo de intervalo entre dois quadros em zero segundos e os quadros totais de imagem como 200 quadros para fornecer cerca de 440 segundos de microscopia contínua em um experimento individual.
Pegue o prato contendo células transfectadas com mito GFP ou proteína fluorescente amarela circularmente permutada da incubadora e coloque o prato no estágio do microscópio. Verifique o estado do laser femtosegundo para garantir que o foco do laser femtosegundo esteja localizado no centro do campo de visão. Em seguida, ajuste uma seta de referência no centro da janela de imagem fluorescente para indicar a posição do foco.
Em seguida, defina a potência do laser femtosegundo em cinco a 30 miliwatts com o laser a 810 nanômetros e de 10 a 40 miliwatts para o laser a 1040 nanômetros. Defina o tempo de abertura do obturador para 05 a 0,1 segundos. Use o modo de varredura rápida para selecionar a célula alvo que está bem expressando mito GFP ou a proteína fluorescente amarela circularmente permutada com mira mitocondrial.
Selecione uma mitocôndria aleatoriamente na célula alvo como o sujeito experimental. Em seguida, mova o estágio do microscópio para localizar a estrutura tubular mitocondrial alvo no centro do campo de visão, através do modo de varredura rápida, conforme indicado pela seta de referência. Clique no botão iniciar para iniciar a imagem contínua.
Finalmente, abra o obturador a qualquer momento predefinido para fornecer a estimulação a laser femtosegundo na estrutura tubular mitocondrial alvo. Aguarde até que o processo de imagem seja concluído e, em seguida, salve os dados de imagem para análise de dados posteriores. Utilizando o método apresentado neste protocolo, O ERK2 transloca-se para o núcleo após ser tratado com um pequeno flash do laser femtosegundo.
A fluorescência ERK2-GFP atinge o máximo após vários minutos de estimulação a laser femtosegundo. As moléculas ERK2 serão desfosforiladas após ativarem substratos a jusante no núcleo e, em seguida, o ERK2 volta ao citoplasma indicado por uma diminuição da fluorescência GFP nuclear. O ERK2 pode ser ativado várias vezes por várias estimulações fotográficas.
Portanto, é possível manipular o padrão de sinal ERK2 precisamente controlando o tempo de intervalo entre múltiplos estímulos. Além disso, o ERK2 pode ocasionalmente ser ativado em células adjacentes ao redor da célula estimulada. Esta observação indica que algumas moléculas difusíveis podem ser liberadas pela célula tratada com o laser femtosegundo para ativar ORK2 nas células adjacentes.
A fosforilação da proteína a jusante ERK2 eIF4E pode ser confirmada individualizada por microscopia de imunofluorescência. Este resultado indica que a estimulação a laser femtosegundo pode ativar com sucesso a via de sinalização ERK. Flashes oxidativos mitocondriais ou mitoflashes são explosões oxidativas em mitocôndrias que raiz de dinâmica molecular complexa.
A implementação deste esquema de estimulação de fotos resultou em uma excitação mitoflash bem sucedida. Esta estimulação fotográfica também mostra variedades de dinâmicas moleculares mitocondriais, incluindo fragmentação e restauração da morfologia mitocondrial, bem como oscilação do potencial da membrana mitocondrial. Semelhante às mitoflashes ativadas por fotos, esses eventos mitocôndrias têm desempenho diferente com diferentes intensidades de poder.
O mais importante é garantir que o foco, o tamanho e a precisão do laser femtosegundo é uma propriedade para a estimulação nas células. O laser femtosegundo quase infravermelho pode ser perigoso para os usuários. Ao seguir este protocolo, use proteção adequada e impede que o laser se difunda da tabela óptica.
