광유전학과 같은 광학 적 방법은 세포 분자 신호의 정확한 변조를 제공 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 펨토초 레이저 자극에 의한 세포 신호 분자의 경구 광학 조작을 시연했습니다. 우리의 펨토초 레이저를 공초점 현미경으로 결합함으로써, 우리의 기술은 펨토초 레이저 자극및 공초점 현미경검사법에 의한 실시간 분자 동적 모니터링에 의해 단일 세포 또는 세포외 수준의 작동을 제공할 수 있습니다.
이 방법은 펨토초 레이저를 적절한 방식으로 시스템에 결합하여 모든 형광 현미경 시스템에 적용될 수 있다. 처음으로 우리의 방법을 시도하는 사람을 위해, 레이저 시설의 별도의 지침을 따르거나 실험실 펨토 초 레이저 소스를 작동 할 때 전문가의 지침을 추구하시기 바랍니다. 시작하려면 펨토초 레이저와 공초점 현미경을 켭니다.
반사 거울을 사용하여 펨토초 레이저 빔을 기계식 셔터를 통해 지시합니다. 다음으로, 한 쌍의 렌즈로 구성된 릴레이 망원경을 설정하여 전송 빔 폭을 확장합니다. 이는 목표의 뒷구와 일치해야 합니다.
이제 반사 거울을 조종하여 확장된 빔을 현미경으로 정렬합니다. 여기서 지적한 두 개의 반사 거울을 조정하여 펨토초 레이저의 초점을 시야 의 중심으로 조정합니다. 마지막으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 레이저를 측정하고 조정합니다.
표준 기술을 사용하여 배양 헬라 세포. 실험을 수행할 준비가 되면 첨부 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 ERK2-GFP로 세포를 변형시합니다. 다음으로, 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 펨토초 레이저를 켭니다.
레이저의 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어를 엽니다. 488 나노미터에서 흥분 레이저를 설정하고 전력 레벨을 0.1 밀리와트로 설정합니다.
이미징 크기를 512x 512픽셀로 설정하고 각 픽셀의 간격 시간을 2.4 마이크로초로 설정합니다. 그런 다음, 6초에 두 프레임 사이의 간격 시간을 설정하여 세포에 대한 사진 표백 및 사진 손상을 최소화합니다. 또한, 개별 실험에서 약 30분의 연속 현미경 검사를 제공하기 위해 총 이미징 프레임을 약 300프레임으로 설정합니다.
인큐베이터에서 ERK2-GFP로 감염된 헬라 세포를 함유한 접시를 가져 와서 현미경 단계에 접시를 놓습니다. 소프트웨어에서 빠른 스캐닝 모드를 시작하고 목적을 조정하여 세포의 선명한 형광 이미지를 획득합니다. 그런 다음 빠른 스캐닝을 중지하고 CCD 카메라를 사용하여 밝은 필드 이미징 모드로 전환합니다.
셔터를 열고 중계 망원경의 두 렌즈 사이의 거리를 조정하여 펨토초 레이저 초점의 직경이 약 2개의 미크론인지 확인합니다. 그런 다음 셔터를 닫고 조정을 완료합니다. 810 나노미터 레이저의 경우 15~40밀리와트에서 펨토초 레이저의 출력을 설정하거나 1040 나노미터 레이저의 경우 20~60밀리와트에 전력을 공급합니다.
그런 다음 셔터 개통 시간을 05초에서 0.2초로 설정합니다. 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 ERK2-GFP를 강력하게 표현하는 대상 셀을 선택합니다. 일단 발견되면, 밝은 필드 이미징에서 볼 의 중심에 있도록 선택한 대상 셀의 사이토솔 영역을 국소화하기 위해 단계를 이동합니다.
중앙을 중심으로 시작 버튼을 클릭하여 연속 이미징을 시작합니다. 미리 정의된 시간 슬롯에서 셔터를 열어 펨토초 레이저 자극을 대상 셀에 전달합니다. 이미징 프로세스가 완료되면 추가 분석을 위해 이미징 데이터를 저장합니다.
펨토초 레이저의 힘을 15~40밀리와트, 810나노미터, 20~60밀리와트, 1040나노미터로 시편에서 설정한다. 이어서, 인큐베이터로부터 ERK2-GFP로 감염된 세포를 함유한 접시를 가지고 현미경 단계에 놓는다. 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 ERK2-GFP를 잘 표현하는 대상 셀을 선택합니다.
그런 다음, 공초점 이미징 프로세스를 설정하고 화상 진찰 과정에서 자극 프레임으로 특수 스캐닝 프레임을 정의한다. 자극 프레임의 매개 변수를 정의합니다. 표적 세포내 핵에 가까운 사이토솔 지역에 2~3제곱미크론의 스캐닝 영역을 설정한다.
총 검색 시간을 0.1초에서 0.2초로 설정합니다. 간격 시간을 6초로 설정하고 총 이미징 프레임을 약 300프레임으로 설정하여 약 30분의 연속 현미경 검사를 제공합니다. 추가 데이터 분석을 위해 이미징 데이터를 저장합니다.
자극 프레임에서 레이저 스캐닝이 떨어질 때만 열리는 미리 정의된 사진 자극 영역에 따라 펨토초 레이저의 셔터를 공초점 스캐닝과 동기화합니다. 시작 버튼을 클릭하여 연속 현미경 이미징 프로세스를 시작합니다. 미토콘드리아 형태역학을 관찰하기 위해 미토-GFP를 가진 겔라 세포를 형광으로 표시하거나 미토콘드리아또는 미토-cpYFP를 사용하여 미토플라스트를 관찰한다.
트랜스펙트 후 펨토초 레이저를 켜고 셔터가 닫히도록 합니다. 그런 다음 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켭니다. 488 나노미터에서 흥분 레이저를 설정합니다.
이어서, 488 나노미터 레이저의 전력 레벨을 0.1 밀리와트로 설정하였다. 또한 이미징 크기를 512x 512픽셀로 설정하고 각 프레임의 총 이미징 시간을 2.2초로 설정합니다. 그런 다음, 2프레임 사이의 간격 시간을 0초로 설정하고 총 이미징 프레임은 200프레임으로 설정하여 개별 실험에서 약 440초의 연속 현미경 을 제공합니다.
미토 GFP 또는 미토콘드리아 표적 원형으로 변류된 노란 형광 단백질을 함유한 세포를 함유한 접시를 인큐베이터에서 꺼내 현미경 단계에 놓습니다. 펨토초 레이저의 초점이 시야 중앙에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 형광 이미징 창의 중앙에 참조 화살표를 설정하여 초점의 위치를 나타냅니다.
다음으로, 810 나노미터에서 레이저로 5~30밀리와트에서 펨토초 레이저의 파워를 설정하고 1040 나노미터에서 레이저용 10~40밀리와트에 레이저를 장착한다. 셔터의 오프닝 시간을 05초에서 0.1초로 설정합니다. 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 미토 GFP 또는 미토콘드리아 표적 원형 으로 변류된 황형 단백질을 잘 발현하는 표적 세포를 선택하십시오.
실험 대상 셀에서 무작위로 하나의 미토콘드리온을 선택합니다. 다음으로, 현미경 단계를 이동하여 기준 화살표에 의해 표시된 바와 같이 빠른 스캐닝 모드로 시야의 중심에서 표적 미토콘드리아 관 구조를 국소화한다. 시작 버튼을 클릭하여 연속 이미징을 시작합니다.
마지막으로, 미리 정의된 시간에 셔터를 열어 펨토컨드 레이저 자극을 표적 미토콘드리아 관 구조로 전달합니다. 이미징 프로세스가 완료될 때까지 기다린 다음 이미징 데이터를 저장하여 추가 데이터 분석을 합니다. ERK2는 이 프로토콜에 제시된 방법을 사용하여 펨토초 레이저의 짧은 플래시로 처리된 후 핵으로 배회합니다.
ERK2-GFP 형광은 몇 분 동안 펨토초 레이저 자극 을 받은 후 최대값에 도달합니다. ERK2 분자는 핵에서 하류 기판을 활성화한 후 탈포화되고 ERK2는 핵 GFP 형광의 감소로 표시된 세포질로 돌아온다. ERK2는 여러 사진 자극에 의해 여러 번 활성화될 수 있다.
따라서 여러 자극 사이의 간격 시간을 제어하여 ERK2 신호 패턴을 정밀하게 조작할 수 있다. 또한, ERK2는 자극된 셀 주위의 인접 한 세포에서 때때로 활성화 될 수 있다. 이러한 관찰은 일부 확산 분자가 인접한 세포에서 ERK2를 활성화하기 위해 펨토초 레이저로 처리된 세포에 의해 방출될 수 있음을 나타낸다.
ERK2 다운스트림 단백질 eIF4E의 인광은 면역형광 현미경 검사법에 의해 개별화된 것으로 확인될 수 있다. 이 결과는 펨토초 레이저 자극이 ERK 신호 경로를 성공적으로 활성화할 수 있음을 나타냅니다. 미토콘드리아 산화 플래시 또는 미토프속눈썹은 미토콘드리아에서 복잡한 분자 역학으로부터 뿌리를 뿌리는 산화 파열입니다.
이 사진 자극 체계를 구현하면 성공적인 미토플래시 여기가 발생했습니다. 이 사진 자극은 또한 미토콘드리아 형태의 단편화 및 복원뿐만 아니라 미토콘드리아 막 전위진동을 포함한 미토콘드리아 분자 역학의 품종을 보여줍니다. 사진 활성화 된 mitof속눈썹과 마찬가지로,이 미토콘드리아 이벤트는 다른 전력 강도와 다른 성능을 가지고 있습니다.
가장 중요한 것은 펨토초 레이저의 초점, 크기 및 정밀도가 세포 내 자극의 특성인지 확인하는 것입니다. 근적외선 펨토초 레이저는 사용자에게 위험할 수 있습니다. 이 프로토콜을 따르는 경우 적절한 보호 기능을 착용하고 레이저가 광학 테이블에서 확산되는 것을 방지합니다.
