يمكن أن توفر الطرق البصرية، مثل optogenetics التشكيل الدقيق للإشارات الجزيئية الخلوية. أظهر بروتوكولنا التلاعب البصري الفموي للجزيئات إشارة الخلوية عن طريق تحفيز الليزر femtosecond. عن طريق اقتران ليزر femtosecond لدينا في المجهر confocal، يمكن أن توفر لدينا تقنية عملية على مستوى الخلية الواحدة أو دون الخلية عن طريق تحفيز الليزر femtosecond والرصد الديناميكي الجزيئي في الوقت الحقيقي عن طريق المجهر confocal.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي أنظمة المجهر الفلورسنت عن طريق اقتران ليزر femtosecond في النظام بطريقة سليمة. لأي شخص يحاول طريقتنا للمرة الأولى، يرجى اتباع تعليمات منفصلة من مرفق الليزر أو التماس التوجيه من المهنيين عند تشغيل مصدر ليزر femtosecond مختبر. للبدء، قم بتشغيل ليزر الفومتو ثانية والمجهر confocal.
استخدم المرايا العاكسة لتوجيه شعاع الليزر الفيمتو ثانية من خلال مصراع ميكانيكي. بعد ذلك، قم بتعيين تلسكوب ترحيل يتكون من زوج من العدسات لتوسيع عرض شعاع الإرسال. وينبغي أن يكون ذلك متسقا مع الفتحة الخلفية للهدف.
الآن، توجيه المرايا العاكسة لمحاذاة شعاع الموسعة في المجهر. ضبط اثنين من المرايا العاكسة ، وأشار هنا ، لضبط تركيز ليزر femtosecond إلى مركز مجال الرؤية. وأخيراً، قم بقياس وضبط أشعة الليزر كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.
ثقافة خلايا هيلا باستخدام التقنيات القياسية. عندما تكون جاهزة لتنفيذ التجربة، transfect الخلايا مع ERK2-GFP كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. بعد ذلك، قم بتشغيل المجهر الناكوسيل المسح بالليزر و الليزر femtosecond.
تأكد من إغلاق مصراع الليزر. ثم، افتح برنامج المجهر. تعيين الليزر الإثارة في 488 نانومتر، وتعيين مستوى قوتها في 0.1 مللي واط.
تعيين حجم التصوير 512 في 512 بكسل، ووقت الفاصل الزمني لكل بكسل كميكرو ثانية 2.4. ثم، تعيين الوقت الفاصل الزمني بين إطارين في ست ثوان للحد من تبييض الصورة وتلف الصورة للخلايا. أيضا، تعيين إطارات التصوير الكلي في حوالي 300 إطار لتوفير حوالي 30 دقيقة من المجهر المستمر في تجربة فردية.
خذ الطبق الذي يحتوي على خلايا هيلا المصابة بـ ERK2-GFP من الحاضنة، ووضع الطبق على مرحلة المجهر. في البرنامج ، بدء وضع المسح الضوئي السريع ، وضبط الهدف للحصول على صور الفلورسنت واضحة من الخلايا. ثم، توقف عن المسح الضوئي السريع والتبديل إلى وضع التصوير في المجال الساطع باستخدام كاميرا CCD.
افتح الغالق واضبط المسافة بين العدسات من تلسكوب التتابع لضمان أن قطر تركيز الليزر الفيمتوس ثانية حوالي اثنين من ميكرون. ثم أغلق الغالق لإكمال التعديل. قم بتعيين قوة ليزر الفيمتوس ثانية على 15 إلى 40 مللي وات ليزر 810 نانومتر، أو 20 إلى 60 مللي واط ليزر 1040 نانومتر.
ثم، تعيين وقت فتح مصراع الكاميرا في 05 إلى 0.2 ثانية. استخدم وضع المسح السريع لتحديد خلية مستهدفة تعبر بقوة عن ERK2-GFP. بمجرد العثور عليها، نقل المرحلة من أجل توطين منطقة cytosol من الخلية المستهدفة المحددة بحيث يكون في وسط مجال الرؤية عندما تحت التصوير المجال مشرق.
بمجرد توسيطه، انقر على زر البدء لبدء التصوير المستمر. افتح الغالق في أي فتحة زمنية محددة مسبقًا لتقديم تحفيز الليزر الفيمتو ثانية إلى الخلية المستهدفة. عند اكتمال عملية التصوير، احفظ بيانات التصوير لمزيد من التحليل.
تعيين قوة ليزر الفيمتوس ثانية في 15 إلى 40 مللي و 810 نانومتر و 20 إلى 60 مللي واط و 1040 نانومتر في العينة. ثم، تأخذ الطبق الذي يحتوي على الخلايا التي تحتوي على المصابين ERK2-GFP من الحاضنة ووضعها على مرحلة المجهر. استخدام وضع المسح السريع لتحديد الخلية المستهدفة التعبير بشكل جيد ERK2-GFP.
ثم، قم بتعيين عملية التصوير confocal وتحديد إطار المسح الضوئي الخاص كإطار التحفيز في عملية التصوير. تحديد معلمة إطار التحفيز. تعيين منطقة المسح من اثنين إلى ثلاثة من ثلاثة ميكرون مربع في منطقة cytosol قريبة من النواة في الخلية المستهدفة.
تعيين وقت المسح الكلي في 0.1 إلى 0.2 ثانية. تعيين الوقت الفاصل الزمني بين إطارين في ست ثوان، وتعيين إطارات التصوير الكلي في حوالي 300 إطار لتوفير حوالي 30 دقيقة من المجهر المستمر. حفظ بيانات التصوير لمزيد من تحليل البيانات.
مزامنة مصراع ليزر الفيمتوس ثانية مع ذلك من المسح confocal وفقا لمنطقة التحفيز الصورة المحددة مسبقا والتي هي مفتوحة فقط عندما قطرات المسح الضوئي بالليزر في إطار التحفيز. انقر فوق زر البدء لبدء عملية التصوير المجهري المستمر. لمراقبة ديناميات المورفولوجية الميتوكوندريا، عبر الخلايا هيلا مع الميتو-GFP للإشارة فلوريا الميتوكوندريا، أو قاعدة مع ميتو-cpYFP لمراقبة الميتوفلورام.
بعد transfection، قم بتشغيل ليزر الفمتوز ثانية وتأكد من إغلاق الغالق. ثم، قم بتشغيل المجهر الناكوسي المسح الضوئي بالليزر. تعيين الليزر الإثارة في 488 نانومتر.
ثم، تعيين مستوى الطاقة ليزر 488 نانومتر في 0.1 مللي واط. بالإضافة إلى ذلك، قم بتعيين حجم التصوير إلى 512 في 512 بكسل و وقت التصوير الكلي لكل إطار إلى 2.2 ثانية. ثم، تعيين الفاصل الزمني بين إطارين في ثواني صفر وإطارات التصوير الإجمالية كـ 200 إطار لتوفير حوالي 440 ثانية من المجهر المستمر في تجربة فردية.
خذ الطبق الذي يحتوي على الخلايا المصابة بـ Mito GFP أو البروتين الفلوري الأصفر المُستَهدَف بشكل دائري المُوجَّل من الحاضنة ووضع الطبق على مرحلة المجهر. تحقق من حالة ليزر الفيمتو ثانية للتأكد من أن تركيز ليزر الفيمتو ثانية يقع في وسط مجال الرؤية. ثم قم بتعيين سهم مرجعي في مركز نافذة التصوير الفلورسنت للإشارة إلى موضع التركيز.
بعد ذلك، تعيين قوة ليزر الفيمتوس ثانية في 5-30 miliwatts مع الليزر في 810 نانومتر و 10 إلى 40 مللي واط بالليزر في 1040 نانومتر. تعيين وقت فتح الغالق إلى 05 إلى 0.1 ثانية. استخدم وضع المسح السريع لتحديد الخلية المستهدفة التي تعبر بشكل جيد عن ميتو جي بي أو البروتين الفلوري الأصفر المُستَهدف بالتقدر الميتوكوندري.
حدد الميتوكوندريون واحد عشوائيا في الخلية المستهدفة كما موضوع التجريبية. بعد ذلك، نقل مرحلة المجهر من أجل توطين الهيكل الأنبوبي الميتوكوندريا الهدف في وسط مجال الرؤية عن طريق وضع المسح الضوئي السريع كما هو مبين من قبل السهم المرجعي. انقر فوق زر البدء لبدء التصوير المستمر.
وأخيراً، افتح الغالق في أي وقت محدد مسبقًا لتقديم تحفيز الليزر الفومتو ثانية في الهيكل الأنبوبي الميتوكوندري المستهدف. انتظر حتى تكتمل عملية التصوير ثم احفظ بيانات التصوير لمزيد من تحليل البيانات. باستخدام الطريقة المقدمة في هذا البروتوكول، ERK2 نقل إلى النواة بعد أن تعامل مع ومضة قصيرة من ليزر الفيومتوثان.
ERK2-GFP الفلوريسنس يصل إلى الحد الأقصى بعد عدة دقائق من التحفيز ليزر الفيمتو ثانية. وسوف تكون جزيئات ERK2 dephosphorylated بعد تفعيل ركائز المصب في النواة ومن ثم ERK2 يعود إلى السيتوبلازم المشار إليها من قبل انخفاض الفلورسينسي GFP النووية. ERK2 يمكن تفعيلها عدة مرات عن طريق تحفيز الصور متعددة.
ولذلك، فمن الممكن لمعالجة نمط إشارة ERK2 بدقة عن طريق التحكم في الفاصل الزمني بين المحفزات متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنشيط ERK2 أحيانا في الخلايا المجاورة حول الخلية حفز. تشير هذه الملاحظة إلى أن بعض الجزيئات القابلة للنشر قد يتم تحريرها من قبل الخلية المعالجة بالليزر الفيمتوس ثانية لتنشيط ERK2 في الخلايا المجاورة.
يمكن تأكيد فسفور ERK2 من البروتين المصب eIF4E فردية عن طريق المجهر المناعي. هذه النتيجة تشير إلى أن تحفيز الليزر femtosecond يمكن بنجاح تنشيط مسار إشارة ERK. ومضات المؤكدة الميتوكوندريا أو mitoflashes هي رشقات نارية الأكسدة في الميتوكوندريا أن الجذر من الديناميات الجزيئية المعقدة.
تنفيذ هذا مخطط تحفيز الصور أدى إلى إثارة Mitoflash ناجحة. هذا التحفيز الصورة كما يظهر أنواع من الديناميات الجزيئية الميتوكوندريا بما في ذلك تفتيت واستعادة مورفولوجيا الميتوكوندريا فضلا عن التذبذب من إمكانات غشاء الميتوكوندريا. على غرار الميتوفلا الصورة المنشط، هذه الأحداث الميتوكوندريا لها أداء مختلف مع كثافة الطاقة المختلفة.
الشيء الأكثر أهمية هو التأكد من أن التركيز والحجم والدقة ليزر الفيمتو ثانية هو خاصية لتحفيز في الخلايا. قد يكون ليزر الفومتو ثانية الأشعة تحت الحمراء القريبة خطرًا على المستخدمين. عند اتباع هذا البروتوكول، وارتداء الحماية المناسبة ويمنع الليزر من الانتشار من الجدول البصري.
