用完全纯化的组分重构Msp1提取活性

使用AAA-ATP酶从脂质双层中去除蛋白质是蛋白质质量控制中的常见主题。对这一基本过程的机械理解需要一个重组的系统。以前用AAA-ATP酶重建是复杂和异质的。

我们的系统简单且定义完整。这使我们能够操纵AAA-ATP酶Msp1，底物和脂质环境。首先，在PCR管中加入先前制备的重构缓冲液，纯化的Msp1和TA蛋白以及脂质体，然后将混合物在冰上孵育10分钟。

在孵育过程中，将P200移液器吸头的尖端切成直径约1/8英寸。接下来，彻底涡旋含有生物珠的管子以获得均匀的混合物。然后，快速取下盖子，使用切好的P200移液器吸头将适当体积的微珠转移到空的PCR管中。

一旦10分钟的重构孵育完成，使用未切割的移液器吸头，从生物磁珠中除去所有液体。然后，用生物磁珠将100微升的重构转移到管中，并使其在轮子上旋转16小时。第二天，在PicoFuge中旋转管以沉淀珠子，然后将重组材料转移到干净的PCR管中并将管保持在冰上。

为了去除无法重建到脂质体中的蛋白质，用提取缓冲液平衡谷胱甘肽离心柱，这通常涉及用400微升缓冲液洗涤三轮，然后离心以除去缓冲液。接下来，将每个伴侣的五微摩尔加入到重组材料中，然后加入100微升的提取缓冲液，使体积达到200微升。将该混合物加入平衡的谷胱甘肽离心柱中，然后插入离心柱并旋转30分钟，使伴侣与树脂结合。

旋转后，短暂旋转列。收集流出物，这是预先清除的聚集蛋白质耗尽的物质。将其放在冰上，直接进行提取测定。

准备用于SDS-PAGE分析的管子。向输入管中加入45微升双蒸馏水，向流式管中加入40微升水，向每个管中加入16.6微升4X SDS-PAGE加载缓冲液。对于提取测定，准备提取反应并用提取缓冲液将最终体积调高至200微升。

然后，在30摄氏度的热块中预热提取测定两分钟。为了启动测定，将ATP加入到两毫摩尔的终浓度。在PicoFuge中旋转管子5秒钟，然后在30摄氏度下孵育30分钟。

在孵育过程中，取一个五微升的反应样品并将其加入输入管中。此外，如前所述，在提取测定中为每个样品平衡一个谷胱甘肽离心柱。一旦30分钟的孵育完成，向管中加入200微升提取缓冲液，使总体积达到400微升。

然后，将该反应加入平衡的谷胱甘肽树脂中，并使其在4摄氏度下旋转30分钟。旋转后，旋转色谱柱以收集流出物，然后取10微升样品用于流通管。用400微升的提取缓冲液洗涤树脂两次，每次洗涤后丢弃流出物。

第三次洗涤后，保持流过，取50微升样品用于洗涤管。接下来，通过将还原谷胱甘肽加入到提取缓冲液中最终浓度为5毫摩尔来制备5毫升洗脱缓冲液。向离心柱中加入200微升洗脱缓冲液并孵育5分钟。

然后，离心柱并收集流出物。再次重复洗脱步骤。第二次洗脱后，从洗脱样品中取50微升等分试样，并将其添加到洗脱管中。

运行蛋白质印迹后，可以通过比较洗脱组分中底物的量和输入级分来确定提取效率。流通中的信号显示出一定的可变性，但一般与输入分数相似，洗涤分数中没有信号。通常，阳性对照的提取效率约为10%，阴性对照的提取效率约为1%至2%。

当重建条件未优化时，阳性和阴性样品之间的提取水平相当。这项技术使我们的实验室能够测试底物的生物物理特性，影响Msp1的识别。