该协议之所以重要，是因为它通过技术组合浓缩了细胞外囊泡、EV，同时允许将病毒与 EV 分离。该方法最大限度地利用超离心金标准的EV恢复，用于多个下游分析和无病毒EV准备的表征。该协议是研究EV和病毒感染的的理想之选。
此方法可适用于其他病毒系统，如 HTLV、埃博拉、寨卡等。我希望第一次使用这种方法的用户能与纳米粒子制备斗争，因此我们建议仔细遵循我们的规范。根据系统的不同，可能需要进行一些优化。
此方法的可视化演示对于说明协议的整体工作流程和细微差别非常重要，这将减少首次使用的用户的时间和错误。首先准备来自受感染或转染细胞的培养上一体。培养约10毫升的晚日志细胞在37摄氏度和5%的二氧化碳5天，确保所有的介质试剂不含细胞外囊泡。
培养就绪后，在3000次G下离心，将细胞分粒5分钟，然后丢弃颗粒。使用无菌 0.22 微米过滤器过滤上清液，并在干净的管中收集滤液。将同等体积的PEG沉淀试剂加入滤物中，并多次反转管进行混合。
在四摄氏度下孵育混合物过夜。孵育后，将混合物在1500次G下离心30分钟，产生异质细胞外囊泡或EV颗粒。丢弃上一级液，在150至300微升1X PBS中重新悬浮颗粒，无钙和镁。
在准备密度梯度的同时，将颗粒留在冰上。准备碘桑醇密度梯度介质，具有 11 个密度分数，范围从 6 到 18% 碘桑醇，如手稿中所述。通过涡旋混合每个管，将密度分数分层到干净干燥的摆动铲斗超离心管中。
将重新悬浮的 EV 颗粒添加到分层梯度的顶部，并在 10，000 倍 G 和 4 摄氏度的温度下超离心管 90 分钟。小心地将每个分数从超离心管转移到新的微离心管。通过混合NT80、NT82和1X-PBS的等量，准备30%的纳米颗粒用于EV分数浓缩。
漩涡纳米粒子混合物，以确保均匀性。在每个密度分数中加入30微升的泥浆，通过移液或倒置管进行混合。最关键的一步是在密度梯度分离之后添加纳米物品来浓缩EV。
没有这个，EV 恢复很差。在四摄氏度下一夜之间旋转含有密度分数的纳米粒子。然后在室温下将密度分数在20，000倍G下离心5分钟。
丢弃液体，用 1X-PBS 清洗 EV 颗粒两次。为了准备RNA分离的颗粒，根据手稿说明，重新悬浮50微升的自洗、脱水、过滤和脱粒处理。然后，可以使用商业试剂盒分离RNA。
对于凝胶电泳分析，将颗粒重新悬浮在 15 微升 Laemmli 缓冲液中。将样品加热到 95 摄氏度三分钟。再重复加热步骤两次，轻轻旋转，并在热循环之间旋转样品。
在20，000倍G下将样品离心15秒，将上看液直接加载到凝胶上。为了获得最佳效果，请限制加载到凝胶上的颗粒量，并在 100 伏电压下运行，以防止任何加载的纳米粒子进入凝胶。PEG 沉淀比传统的超离心相比，可显著提高 EV 回收效率。
当使用 10 毫升培养素时，这种方法的收率比超离心高大约 500 倍。这种方法还提高了外体分离效率，这通过更高水平的外体标记蛋白是显而易见的。西方解放军分析显示，CD81增加了3000倍，CD63增加了4倍，CD9增加了40倍。
此外，该协议允许下游研究HIV1感染中的EV中位机制，通过将EV与病毒隔离在病毒中。西方解放军分析表明，EV在三小部分人群中被发现。而病毒只存在于其中两个。
EV 的违规 10.8 到 12 没有病毒污染。最重要的是要记住，纳米粒子对于最佳的EV浓缩至关重要。他们必须增加。
许多下游测定，如西印、PCR、纯二米分析，在基于板的细胞测定中可以通过质谱法进行。这些允许表征、机械学和/或功能研究。该技术允许特定研究，检查EV货物和功能，而不会污染病毒背景。
这为研究EV的发病机制和开发潜在的治疗方法提供了基础。为了克服该技术的局限性，并应用EV制备和隔离到大批量，我们建议使用先进的系统，如切线流过滤。在密度梯度分离过程中，使用最危险的仪器是超离心。
确保所有离心管的重量相同，避免不平衡和潜在的转子故障。
