פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מרכז ארסים חוץ-תאיים, כלי רכב חשמליים, באמצעות שילוב של טכנולוגיות, תוך מתן אפשרות להפרדת virions הרחק מרכבים חשמליים. שיטה זו ממקסמת את התאוששות EV מעל תקן הזהב הנוכחי של ultracentrifugation לניתוח ואפיון מרובה במורד הזרם של הכנות EV ללא וירוסים. פרוטוקול זה הוא אידיאלי לחקר זיהומים EV ו ויראלי.
שיטה זו יכולה להיות מותאמת למערכות וירוסים אחרות, כגון HTLV, אבולה, זיקה, ועוד. הייתי מצפה משתמש בפעם הראשונה של שיטה זו להיאבק עם הכנת חלקיקים, ולכן אנו ממליצים בזהירות בעקבות המפרטים שלנו. ייתכן שיהיה צורך במיטוב מסוים, בהתאם למערכת.
הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה להמחשת זרימת העבודה הכוללת ואת הניואנסים של הפרוטוקול, אשר יפחיתו זמן וטעויות עבור משתמשים בפעם הראשונה. התחל בהכנת תרבות על-טבעית מתאים נגועים או מתחלפיים. תרבות כ -10 מיליליטר של תאי יומן מאוחרים במשך חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לוודא כי כל בריאגנטים בינוניים הם ללא זרע חוץ תאי.
כאשר התרבות מוכנה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3, 000 פעמים G במשך חמש דקות להשליך את גלולה. מסננים את העל-טבעי באמצעות מסנן מיקרומטר סטרילי של 0.22 ואוסף את הסינון בצינור נקי. מוסיפים נפח שווה של רייגנטים משקעים PEG לסינון, ולהפוך את הצינור מספר פעמים לערבב.
הדגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס לילה. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התערובת ב 1500 פעמים G במשך 30 דקות, כדי להניב זן חוץ תאי הטרוגניים, או EV, גלולה. השליכו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור ב-150 עד 300 מיקרוליטרים של פיב"ג 1X, ללא סידן ומגנזיום.
שמור את גלולה על קרח, תוך הכנת שיפוע צפיפות. הכינו את המדיום שיפוע צפיפות יודיקסנול עם 11 שברי צפיפות, הנעים בין שישה ל -18% יודיקסנול, כמתואר בכתב היד. מערבבים כל צינור על ידי מערבולת ושכבת שברי הצפיפות לתוך צינור דלי מתנדנד נקי ויבש אולטרהצנטריפוגה.
מוסיפים את גלולת EV המושעית מחדש לראש השיפוע השכבתי ו ultracentrifuge הצינור ב 10, 000 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. מעבירים בזהירות כל שבר מצינור האולטרהצנטריפוגה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. הכן 30% תרחיף של חלקיקים להעשרת שברי EV, על-ידי ערבוב כמויות שוות של NT80, NT82 ו- 1X-PBS.
מערבולת תערובת הננו-חלקיקים כדי להבטיח הומוגניות. מוסיפים 30 מיקרוליטרים של תרחיף לכל שבר צפיפות ומערבבים על ידי צינורות או היפוך הצינורות. השלב הקריטי ביותר הוא תוספת של ננו מאמרים לרכז EV של, בעקבות ההפרדה הדרגתית צפיפות.
בלי זה, התאוששות EV הוא עני. סובב את הננו-חלקיק המכיל שברי צפיפות בן לילה, בארבע מעלות צלזיוס. ואז צנטריפוגה שברי הצפיפות ב 20, 000 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
להשליך את הנוזל ולשטוף את גלולת EV פעמיים עם 1X-PBS. כדי להכין את גלולה לבידוד RNA, להשעות אותו מחדש 50 microliters של מים autoclaved, deionized, מסונן ומטופל עם דמפסיה, על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן ניתן לבודד את ה- RNA באמצעות ערכה מסחרית.
לניתוח עם אלקטרופורזה ג'ל, להשעות מחדש את גלולה ב 15 microliters של חיץ Laemmli. מחממים את הדגימה ל-95 מעלות במשך שלוש דקות. חזור על שלב החימום פעמיים נוספות, מערבולת בעדינות וסובב את המדגם למטה בין מחזורי החום.
צנטריפוגה את הדגימה במשך 15 שניות ב 20, 000 פעמים G, ולהעמיס את supernatant ישירות על הג'ל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להגביל את כמות החלקיקים טעון על הג'ל, ולהפעיל אותו ב 100 וולט, כדי למנוע כל חלקיקים טעונים מלהיכנס לג'ל. משקעים PEG מאפשר התאוששות יעילה יותר באופן משמעותי EV, מאשר אולטרה צנטריפוגה מסורתית.
בעת שימוש ב-10 מיליליטר של תרבות, גישה זו גורמת לתפוקה גבוהה פי 500 בערך מאשר אולטרהצנטריפוגה. גישה זו מביאה גם ליעילות בידוד מוגברת של אקסוזומים, אשר ניכרת באמצעות רמות גבוהות יותר של חלבוני סמן אקסוזום. ניתוח PLA המערבי מראה, עלייה של פי 3000 CD81, עלייה של פי ארבעה CD63 וגידול של פי 40 CD9.
יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר מחקרים במורד הזרם של מנגנונים מתווכו EV בזיהום HIV1, על ידי בידוד EV של מ verions. ניתוח PLA המערבי מראה כי EV של נמצאים בשלוש אוכלוסיות שבר. בעוד הנגיף קיים רק בשניים מהם.
העבירה של EV 10.8 עד 12 הם ללא זיהום וירוס. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא כי חלקיקים חיוניים להעשרה אופטימלית EV. התוספת שלהם היא חובה.
ניתן לבצע בדיקות רבות במורד הזרם, כגון כתם מערבי, PCR, ניתוח דיומאך טהור על ידי ספקטרומטריית מסה בתשקיף תאי מבוסס צלחת. אלה מאפשרים אפיון, מחקרים מכניסטיים ו/או פונקציונליים. טכניקה זו מאפשרת מחקרים ספציפיים הבוחנים מטען EV ופונקציונליות מבלי לזהם רקע ויראלי.
זה מספק בסיס לחקר EV של פתוגנזה ופיתוח של טיפולים פוטנציאליים. כדי להתגבר על המגבלות של טכניקה זו, ולהחיל הכנת EV ובידוד על כמויות גדולות, אנו ממליצים על שימוש במערכות מתקדמות, כגון סינון זרימה משיק. המכשיר המסוכן ביותר לשימוש הוא אולטרהצנטריפוגה, במהלך הפרדת שיפוע צפיפות.
ודא כי כל צינורות צנטריפוגה משקל זהה, כדי למנוע חוסר איזון וכישלון רוטור פוטנציאלי.
