このプロトコルは、細胞外小胞、EVを融合させながら、EVからビリオンを分離できるため、重要です。この方法は、ウイルスフリーEV準備の複数のダウンストリーム分析と特性評価のための超遠心分離の現在のゴールドスタンダードを上回るEV回復を最大化します。このプロトコルはEVとウイルス感染の研究に最適です。
この方法は、HTLV、エボラ、ジカ、および多くなどの他のウイルスシステムに適応することができます。私は、この方法の初めてのユーザーがナノ粒子の調製に苦労することを期待するので、我々は慎重に我々の仕様に従うことをお勧めします。システムによっては、何らかの最適化が必要な場合があります。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、プロトコルの全体的な流れとニュアンスを説明するために重要であり、初めてのユーザーの時間と間違いを減らすことができます。まず、感染した細胞またはトランスフェクトされた細胞から培養上清を調製することから始めます。約10ミリリットルの後期ログ細胞を摂氏37度で5日間培養し、5%の二酸化炭素を培養し、すべての培地試薬に細胞外小胞が含まれないようにする。
培養ができたら、5分間Gの3,000倍で遠心分離して細胞をペレット化し、ペレットを捨てる。滅菌0.22マイクロメートルフィルターで上清をフィルターし、きれいなチューブに濾液を集める。濾液に等量のPEG沈殿試薬を加え、チューブを数回反転して混合します。
一晩摂氏4度で混合物をインキュベートします。インキュベーション後、混合物を1500回Gで30分間遠心分離し、異種の細胞外小胞、またはEV、ペレットを得た。上清を捨て、カルシウム及びマグネシウムを含まずに1XPBSの150〜300マイクロリットルでペレットを再懸濁する。
密度勾配を準備しながら、氷の上にペレットを保ちます。原稿に記載されているように、6〜18%の範囲の11密度画分でイオデキサノール密度勾配培地を準備します。各チューブを渦巻きで混ぜ、密度分率を清潔で乾燥したスイングバケット超遠心チューブに重ね合わせます。
再懸濁したEVペレットを層状グラデーションの上部に加え、チューブを10,000倍G、摂氏4度で90分間超遠心分離します。慎重に新しいマイクロ遠心チューブに超遠心チューブから各分を転送します。NT80、NT82、1X-PBSの等量を混合して、EV画分濃縮のためのナノ粒子の30%スラリーを調製します。
ナノ粒子混合物をボルテックスして均質性を確保する。各密度の分数にスラリーの30マイクロリットルを加え、管をピペットまたは反転させることによって混ぜます。最も重要なステップは、密度勾配分離に続いて、EVを濃縮するためのナノ物品の添加です。
これがなければ、EVの回復は貧弱です。密度画分を含むナノ粒子を摂氏4度で一晩回転させます。その後、密度分率を室温で5分間Gの20,000倍に遠心する。
液体を捨て、EVペレットを1X-PBSで2回洗います。RNAの単離のためにペレットを調製するために、原稿の指示に従って、オートクレーブ、脱イオン水の50マイクロリットルを再中断し、濾過し、depsyで処理した。RNAは、次いで、市販のキットを使用して、単離することができます。
ゲル電気泳動による分析のために、ペレットを15マイクロリットルのレムリバッファーに再懸濁します。サンプルを摂氏95度まで3分間加熱します。加熱ステップをさらに2回繰り返し、穏やかに渦を出し、熱サイクルの間にサンプルを回転させます。
試料を20,000倍Gで15秒間遠心し、上澄みをゲルに直接ロードします。最良の結果を得るには、ゲルにロードされる粒子の量を制限し、100ボルトで実行して、ロードされたナノ粒子がゲルに入るのを防ぎます。PEG沈殿は、従来の超遠心分離よりも大幅に効率的なEV回収を可能にする。
10ミリリットルの培養液を使用すると、このアプローチは、超遠心分離よりも約500倍高い収率をもたらす。このアプローチはまた、エキソソームの分離効率の向上をもたらし、これはより高いレベルのエキソソームマーカータンパク質を通じて明らかである。ウェスタンPLA分析は、CD81の3000倍の増加、CD63の4倍の増加およびCD9の40倍の増加を示す。
さらに、このプロトコルは、HIV1感染におけるEV媒介機構の下流の研究を可能にし、EVを脊椎から隔離する。西部PLA分析は、EVが3つの割合の集団に見られることを示しています。ウイルスはそのうちの2つだけに存在しますが。
EVの侵害10.8から12はウイルス汚染の無い。覚えておくべきことは、ナノ粒子が最適なEV濃縮に不可欠であるということです。彼らの追加は必須です。
ウエスタンブロット、PCR、プレートベースの細胞アッセイにおける質量分析による純粋なジオメック分析などの多くの下流アッセイが行うことができる。これらは、特性評価、機械化、および/または機能研究を可能にします。この技術は、ウイルスの背景を汚染することなく、EV貨物と機能性を調べる特定の研究を可能にします。
これは、病因と潜在的な治療薬の開発におけるEVの研究のための基盤を提供します。この技術の限界を克服し、EVの調製と分離を大量に適用するために、我々は、接線流ろ過などの高度なシステムを使用することを推奨します。使用する最も危険な器具は、密度勾配分離の間に、超遠心分離です。
不均衡と潜在的なローターの故障を避けるために、すべての遠心管が同じ重量を重くすることを確認してください。
