Este protocolo es significativo porque concentra vesículas extracelulares, vehículos eléctricos, a través de una combinación de tecnologías, al tiempo que permite la separación de viriones lejos de los vehículos eléctricos. Este método maximiza la recuperación de EV por encima del estándar de oro actual de ultracentrifugación para múltiples análisis aguas abajo y caracterización de preparaciones EV libres de virus. Este protocolo es ideal para el estudio de los vehículos eléctricos y las infecciones virales.
Este método se puede adaptar a otros sistemas de virus, como la HTLV, el ébola, el zika y más. Yo esperaría que un usuario por primera vez de este método para luchar con la preparación de nanopartículas, por lo que recomendamos seguir cuidadosamente nuestras especificaciones. Puede ser necesaria alguna optimización, dependiendo del sistema.
La demostración visual de este método es importante para ilustrar el flujo de trabajo general y los matices del protocolo, lo que reducirá el tiempo y los errores para los usuarios por primera vez. Comience por preparar el sobrenadante de cultivo de células infectadas o trans infectadas. Cultivo de aproximadamente 10 mililitros de células de tronco tardías durante cinco días a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono, asegurándose de que todos los reactivos medios estén libres de vesículas extracelulares.
Cuando el cultivo esté listo, pele el pellet de las células por centrifugación a 3.000 veces G durante cinco minutos y deseche el pellet. Filtrar el sobrenadante con un filtro estéril de 0,22 micrómetros y recoger el filtrado en un tubo limpio. Añadir un volumen igual de reactivos de precipitación PEG al filtrado, e invertir el tubo varias veces para mezclar.
Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, centrifugar la mezcla a 1500 veces G durante 30 minutos, para producir una vesícula extracelular heterogénea, o EV, pellet. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 150 a 300 microlitros de 1X PBS, sin calcio ni magnesio.
Mantenga el pellet sobre hielo, mientras prepara un gradiente de densidad. Preparar el medio de gradiente de densidad de iodixanol con 11 fracciones de densidad, que van de seis a 18%iodixanol, como se describe en el manuscrito. Mezcle cada tubo por vórtice y capa de las fracciones de densidad en un tubo de ultracentrífuga de cubo oscilante limpio y seco.
Agregue el pellet EV re-suspendido a la parte superior del gradiente en capas y ultracentrifríe el tubo a 10.000 veces G, y cuatro grados Celsius durante 90 minutos. Transfiera cuidadosamente cada fracción del tubo de ultracentrífuga a un nuevo tubo de microcentrífuga. Preparar un 30% de lodos de nanopartículas para el enriquecimiento de fracciones EV, mezclando volúmenes iguales de NT80, NT82 y 1X-PBS.
Vórtice la mezcla de nanopartículas para asegurar la homogeneidad. Añadir 30 microlitros de la suspensión a cada fracción de densidad y mezclar pipeteando o invirtiendo los tubos. El paso más crítico es la adición de los nano-artículos para concentrar los EV, después de la separación del gradiente de densidad.
Sin esto, la recuperación de EV es pobre. Gire la nanopartícula que contiene fracciones de densidad durante la noche, a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifugar las fracciones de densidad a 20.000 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Deseche el líquido y lave el pellet EV dos veces con 1X-PBS. Para preparar el pellet para el aislamiento de ARN, re-suspenderlo 50 microlitros de agua autoclavizada, desionizada, filtrada y tratada con depsy, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. El ARN se puede aislar, utilizando un kit comercial.
Para el análisis con electroforesis de gel, vuelva a suspender el pellet en 15 microlitros de tampli de laemmli. Caliente la muestra a 95 grados centígrados durante tres minutos. Repita el paso de calentamiento dos veces más, vórtice suavemente y girando la muestra hacia abajo entre ciclos de calor.
Centrifugar la muestra durante 15 segundos a 20.000 veces G, y cargue el sobrenadante directamente sobre el gel. Para obtener mejores resultados, limite la cantidad de partículas cargadas en el gel, y ejecútela a 100 voltios, para evitar que las nanopartículas cargadas entren en el gel. La precipitación PEG permite una recuperación EV significativamente más eficiente que la ultracentrifugación tradicional.
Cuando se utilizan 10 mililitros de cultivo, este enfoque da como resultado un rendimiento de aproximadamente 500 veces mayor que la ultracentrifugación. Este enfoque también resulta en una mayor eficiencia de aislamiento de los exosomas, que es evidente a través de mayores niveles de proteínas marcadoras exosomas. El análisis de PLA occidental muestra, un aumento de 3000 veces en CD81, un aumento de cuatro veces en CD63 y un aumento de 40 veces en CD9.
Además, este protocolo permite estudios posteriores de mecanismos mediados por EV en la infección por VIH1, aislando los vehículos eléctricos de los veriones. El análisis pla occidental muestra que los vehículos eléctricos se encuentran en tres poblaciones fraccionarias. Mientras que el virus está presente en sólo dos de ellos.
La infracción de EV 10.8 a 12 está libre de contaminación por virus. Lo más importante a recordar es que las nanopartículas son cruciales para un enriquecimiento ev óptimo. Su adición es imprescindible.
Se pueden realizar muchos ensayos aguas abajo, como la mancha occidental, la PCR, el análisis de diomez pura por espectrometría de masas en ensayos celulares basados en placas. Estos permiten la caracterización, estudios mecánicos y/o funcionales. Esta técnica permite estudios específicos que examinan la carga EV y la funcionalidad sin contaminar el fondo viral.
Esto proporciona una base para el estudio de los vehículos eléctricos en la patogénesis y el desarrollo de posibles terapias. Para superar las limitaciones de esta técnica, y para aplicar la preparación y el aislamiento de EV a grandes volúmenes, recomendamos el uso de sistemas avanzados, como la filtración de flujo tangencial. El instrumento más peligroso de usar es la ultracentrífuga, durante la separación del gradiente de densidad.
Asegúrese de que todos los tubos centrífugos pesan igual, para evitar desequilibrios y posibles fallos del rotor.
