Ce protocole est significatif parce qu’il concentre les vésicules extracellulaires, les VE, à travers une combinaison de technologies, tout en permettant la séparation des virions loin des VE. Cette méthode maximise la récupération ev au-dessus de l’étalon-or actuel de l’ultracentrifugation pour l’analyse en aval multiple et la caractérisation des préparations ev sans virus. Ce protocole est idéal pour l’étude des ve et des infections virales.
Cette méthode peut être adaptée à d’autres systèmes de virus, tels que le HTLV, Ebola, Zika, et plus encore. Je m’attends à ce qu’un premier utilisateur de cette méthode lutte avec la préparation des nanoparticules, nous vous recommandons donc de suivre attentivement nos spécifications. Une certaine optimisation peut être nécessaire, selon le système.
La démonstration visuelle de cette méthode est importante pour illustrer le flux de travail global et les nuances du protocole, ce qui réduira le temps et les erreurs pour les utilisateurs pour la première fois. Commencez par préparer le supernatant de culture à partir de cellules infectées ou transfectées. Culture d’environ 10 millilitres de cellules en rondins tardifs pendant cinq jours à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant que tous les réaccès moyens sont exempts de vésicules extracellulaires.
Quand la culture est prête, pelleter les cellules par centrifugation à 3000 fois G pendant cinq minutes et jeter la pastille. Filtrer le supernatant à l’aide d’un filtre stérile de 0,22 micromètre et recueillir le filtrate dans un tube propre. Ajouter un volume égal de réaccents de précipitation PEG au filtrate et inverser le tube plusieurs fois pour mélanger.
Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, centrifuger le mélange à 1500 fois G pendant 30 minutes, pour donner une vésicule extracellulaire hétérogène, ou EV, granulé. Jetez le supernatant et suspendez la pastille en 150 à 300 microlitres de 1X PBS, sans calcium et magnésium.
Gardez la pastille sur la glace, tout en préparant un gradient de densité. Préparer le milieu de gradient de densité iodoxanol avec 11 fractions de densité, allant de six à 18% iodixanol, tel que décrit dans le manuscrit. Mélanger chaque tube par vortex et superposer les fractions de densité dans un tube d’ultracentrifugeuse à godets propre et sec.
Ajouter la pastille EV re-suspendue au sommet du gradient superposé et ultracentrifuger le tube à 10 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 90 minutes. Transférez soigneusement chaque fraction du tube d’ultracentrifugeuse à un nouveau tube de microcentrifugeuse. Préparer une boue de 30% de nanoparticules pour l’enrichissement de la fraction EV, en mélangeant des volumes égaux de NT80, NT82 et 1X-PBS.
Vortex le mélange de nanoparticules pour assurer l’homogénéité. Ajouter 30 microlitres de boue à chaque fraction de densité et mélanger en pipetage ou en inversant les tubes. L’étape la plus critique est l’ajout des nano-articles pour concentrer les EV, suivant la séparation du gradient de densité.
Sans cela, la récupération ev est pauvre. Faites pivoter la nanoparticule contenant des fractions de densité pendant la nuit, à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez les fractions de densité à 20 000 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.
Jeter le liquide et laver la pastille EV deux fois avec 1X-PBS. Pour préparer la pastille à l’isolement de l’ARN, suspendez-la 50 microlitres d’eau autoclavée et déionisée, filtrée et traitée avec depsie, selon les directives manuscrites. L’ARN peut alors être isolé, à l’aide d’un kit commercial.
Pour analyse avec électrophorèse gel, re-suspendre la pastille dans 15 microlitres de tampon Laemmli. Chauffer l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Répétez l’étape de chauffage deux fois de plus, en tourbillonnant doucement et en faisant tourner l’échantillon entre les cycles de chaleur.
Centrifugez l’échantillon pendant 15 secondes à 20 000 fois G, et chargez le supernatant directement sur le gel. Pour de meilleurs résultats, limitez la quantité de particules chargées sur le gel et exécutez-la à 100 volts, afin d’empêcher les nanoparticules chargées d’entrer dans le gel. Les précipitations PEG permettent une récupération significativement plus efficace des EV que l’ultracentrifugation traditionnelle.
Lors de l’utilisation de 10 millilitres de culture, cette approche se traduit par un rendement environ 500 fois plus élevé que l’ultracentrifugation. Cette approche se traduit également par une efficacité d’isolement accrue des exosomes, ce qui est évident à travers des niveaux plus élevés de protéines marqueurs exosome. L’analyse occidentale de l’APL montre une augmentation de 3000 fois du CD81, une quadruple augmentation du CD63 et une augmentation de 40 fois le CD9.
En outre, ce protocole permet d’études en aval des mécanismes 201 de l’infection par le VIH1, en isolant les VE des verions. L’analyse de l’APL de l’Ouest montre que les VE se trouvent dans trois populations fractionnées. Alors que le virus n’est présent que dans deux d’entre eux.
L’infraction d’EV 10,8 à 12 sont exemptes de contamination par le virus. La chose la plus importante à retenir est que les nanoparticules sont cruciales pour l’enrichissement optimal des EV. Leur ajout est un must.
Beaucoup d’analyses en aval, telles que la tache occidentale, PCR, analyse pure de diomech par spectrométrie de masse dans les analyses cellulaires basées sur des plaques peuvent être exécutées. Ceux-ci permettent des études de caractérisation, mécanistes et/ou fonctionnelles. Cette technique permet des études spécifiques qui examinent la cargaison ev et la fonctionnalité sans contaminer le fond viral.
Ceci fournit une base pour étudier ev dans la pathogénie et le développement des thérapeutiques potentielles. Afin de surmonter les limites de cette technique et d’appliquer la préparation et l’isolement des VE à de grands volumes, nous recommandons l’utilisation de systèmes avancés, tels que la filtration tangentielle du débit. L’instrument le plus dangereux à utiliser est l’ultracentrifugeuse, pendant la séparation du gradient de densité.
Assurez-vous que tous les tubes de centrifugeuse pèsent le même poids, afin d’éviter le déséquilibre et la défaillance potentielle du rotor.
