制备和利用新鲜分离的人类分离器平滑肌细胞，用于9-苯酚敏感阳离子电流的表征

Derusor 平滑肌细胞形成膀胱壁，最终促进尿液排空和储存。我们的协议为单平滑肌细胞的新鲜分离提供了一种经过验证的可靠方法。新鲜分离的人类解毒剂平滑肌细胞为单细胞水平的电生理和分子检查提供了机会。

通过研究单德鲁索平滑肌肉细胞从控制，正常和患病的人类膀胱，我们有机会验证药理靶，如离子通道。单人解质平滑肌细胞是电生理实验的理想的选择，如贴片夹电生理学。在这里，我们将介绍一个示例，研究一个名为TRPM4的单离子通道，瞬态受体电位梅拉他汀四通道，这是一个非选择性阳离子通道。

新手可能难以进行解剖和酶治疗步骤，这些步骤需要效率和熟悉程度，包括识别获得新鲜分离的 DSM 细胞的关键重要步骤。熟悉人类膀胱组织学很重要，隔离单个细胞的协议步骤保持弹性，并最初期望使用此协议获得次优细胞。首先检查整个厚度膀胱标本。

将样品固定，粘膜朝上，塞罗萨向下钉在硅胶异样涂层的150毫米圆盘上，里面装满了冰冷的DS，通过尖锐的解剖小心地去除所有的粘膜。切出几个无粘膜的德特鲁索平滑肌肉或 DSM 片。将三到六块 DSM 片放入一个管子中，用一到两毫升预加热的 DS，其中含有木瓜素和二十二醇，或 DS-P。

在37摄氏度下孵育30至45分钟，确保每10至15分钟摇动一次管子。孵育后，从管中取出 DS-P，用冰冷的 DS 短暂清洗 DSM 片断。将带 DSM 件的 DS 转移到新管中并拆下 DS，将 DSM 件留在管的底部。向管子中加入一至两毫升含有胶原酶 II 型或 DS-C 的 DS。

并在37摄氏度下孵育，偶尔摇晃。丢弃 DS-C，用冰冷 DS 清洗经过酶处理的 DSM 片 5 到 10 次。最后一次洗涤后将 DS 留在管内，用火抛光巴斯德移液器轻轻搅拌碎片，释放单个 DSM 细胞。将0.25至1毫升的细胞悬浮液放在倒置显微镜的舞台上的玻璃底部室上，并孵育至少45分钟，使细胞粘附。

然后，从浴缸中去除 DS，然后通过超级输液将其替换为 E 溶液。拉多个贴片电极，对电极尖端进行火抛光，并根据需要将牙蜡涂上牙蜡。将电极短暂浸入溶液中，将移液器溶液填充到贴片电极的尖端，无需安培他林- B。

贴片夹电生理学的成功取决于 DSM 细胞质量和安培他林-B 溶解。用含有安博泰林-B的相同移液器溶液回填电极，将电极安装到连接到贴片夹放大器头阶段的支架上。使用微操纵器将电极放在细胞外溶液表面正下方，以便电极尖端被淹没。

然后，利用商用采集软件的膜测试窗口功能确定电极电阻，将电极推进到感兴趣的电池。使用电极接触电池表面时，通过管状向电极施加温和的快速负压，形成千兆密封。这会导致电极尖端的负压，从而成功进行膜测试确认的千兆密封。

让安博他林-B在30至60分钟内扩散到移液器并插入等离子膜中，形成主要选择性为单价的孔隙。使用膜测试功能继续监控千兆密封。当片面穿孔最佳时，通过调整放大器上的电容和系列电阻的拨盘来消除电容瞬变。

观察到稳定的电压步进阳流后，使用手稿中描述的路由电压步进协议记录电流。应用化合物或生理测试条件进行超输液测试，并记录控制和测试条件以及冲洗的反应。该协议可用于分离健康、新鲜的 DSM 细胞，用于功能和分子研究。

健康的单 DSM 细胞的特点是主轴形状的形态、清晰定义的边缘、细胞周围定义良好的光晕以及在显微镜下观察时半收缩的外观。此外，新鲜分离的DSM细胞对机械刺激和卡巴醇有反应。在随后的贴片实验中，应避免细胞片段和非活体或过度消化的细胞。

分离的细胞已用于安博他林-B穿孔贴片夹实验，其中全细胞电流测量与电压步进诱导或斜坡协议在三个不同的人类DSM细胞。实验表明，TRPM4通道抑制剂9-苯丙醇有效、可逆地抑制了人类DSM阳流。9 苯三醇敏感电流分量表明，在正电压和向外整流时，抑制力更强。

酶处理步骤的条件，步骤2.2和2.3，包括温度，酶治疗的持续时间，酶很多来源和DSM细胞的质量，是获得高质量的人类DSM细胞的关键决定因素。人类 DSM 细胞也非常适合评估细胞内第二信使水平，包括钙和循环 AMP，通过免疫细胞化学检测蛋白质表达，通过原位近位诉讼测定和通过RT-PCR、qRT-PCR、微阵列和下一代测序的mRNA表达。人类 DSM 细胞增进了我们对 BK、钙、TRPM4 通道在膀胱中作用的理解。

未来的发展将允许具体地将电生理或药理特性与转录组或蛋白质组图样联系起来。