Detrusor 부드러운 근육 세포는 궁극적으로 소변 무효화 및 저장을 용이하게 오줌 방광의 벽을 형성한다. 우리의 프로토콜은 단일 부드러운 근육 세포의 갓 격리를위한 검증되고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 갓 분리된 인간 분리기 원활한 근육 세포는 단일 세포 수준에서 전기 생리및 분자 검사를 위한 기회를 제공합니다.
제어에서 단일 detrusor 부드러운 근육 세포를 공부 하 여, 정상, 그리고 병든 인간의 오줌 방광, 우리는 이온 채널 등 약리학적 인 목표를 검증 할 수있는 기회를 가질 수 있습니다. 단일 인간 분리기 부드러운 근육 세포는 패치 클램프 전기 생리학과 같은 전기 생리학적 실험에 이상적입니다. 여기서 우리는 TRPM4라는 단일 이온 채널을 연구하는 예를 제시합니다, 과도 수용체 잠재적 인 melastatin 네 채널, 이는 비 선택적 양이온 채널입니다.
초보자는 새로운 격리된 DSM 세포를 얻기 위한 중요한 중요한 단계를 인식하는 것을 포함하여 효율성과 친숙을 요구하는 해부 및 효소 처리 단계로 투쟁할 수 있습니다. 인간 방광 적고학, 단일 세포를 격리하기위한 프로토콜 단계는 탄력적 남아 있으며 처음에는이 프로토콜을 사용하여 최적이 아닌 세포를 얻을 것으로 예상됩니다. 전체 두께 오줌 방광 표본을 검사하여 시작합니다.
시편, 점막, 세로사를 위쪽으로 향하고 세로사를 실리콘 enantiomer 코팅 150mm 둥근 접시에 얼음 차가운 DS로 채워진 다음 날카로운 해부로 점막을 모두 조심스럽게 제거하십시오. 여러 점막없는 detrusor 부드러운 근육 또는 DSM 조각을 잘라. 3-6개의 DSM 조각을 튜브에 넣고 1~2밀리리터의 미리 따뜻하게 된 DS에 파통과 디티오스레이톨 또는 DS-P가 들어 있습니다.
30~45분간 섭씨 37도에서 배양하여 10분에서 15분마다 튜브를 흔들어 줍니다. 인큐베이션 후 튜브에서 DS-P를 제거하고 얼음 차가운 DS로 DSM 조각을 간략하게 씻으십시오. DSM 조각으로 DS를 새 튜브로 전송하고 DS를 제거하여 DSM 조각을 튜브 하단에 둡시합니다. 콜라게나아제 타입 II 또는 DS-C를 포함하는 DS의 1~2밀리리터를 튜브에 추가합니다.
그리고 가끔 흔들림과 섭씨 37도에서 배양. DS-C를 버리고 효소 처리 DSM 조각을 얼음 차가운 DS로 5~10회 세척합니다. 마지막 세척 후 튜브 내부에 DS를 두고, 부드럽게 단일 DSM 세포를 방출하기 위해 화재 광택 파스퇴르 파이펫으로 조각을 세살. 피펫 0.25 에서 1 밀리리터의 셀 서스펜션은 반전된 현미경의 단계에 앉아 있는 유리 바닥 챔버에 있고 세포가 부착할 수 있도록 적어도 45분 동안 배양한다.
그런 다음, 욕조에서 DS를 제거하고 슈퍼 퓨처를 통해 E 용액으로 대체합니다. 여러 패치 전극을 당기고 전극 팁을 불닦고 필요한 경우 치과 용 왁스의 팁을 코팅하십시오. 용액에 전극을 잠깐 찍어 서 amphotericin-B 없이 파이펫 용액으로 패치 전극의 끝을 채웁니다.
패치 클램프 전기생리학의 성공은 DSM 세포 품질 및 암포테리신-B 용용화에 달려 있습니다. amphotericin-B를 포함하는 동일한 파이펫 용액으로 전극을 백필하고 패치 클램프 증폭기 헤드 스테이지에 연결된 홀더에 전극을 장착합니다. 마이크로 조작기를 사용하여 전극의 끝이 잠수되도록 세포 외 용액의 표면 바로 아래에 전극을 배치하십시오.
이어서, 상용 획득 소프트웨어의 멤브레인 테스트 윈도우 기능을 이용하여 전극 저항성을 결정하고 전극을 관심 있는 셀쪽으로 전진한다. 전극으로 세포 표면에 닿을 때 튜브를 통해 전극에 부드러운 빠른 음압을 가하여 기가 씰을 형성합니다. 이로 인해 전극 끝에 있는 음압이 발생하여 멤브레인 테스트에서 확인한 바와 같이 기가 씰이 성공합니다.
amphotericin-B가 파이펫을 확산시키고 플라즈마 멤브레인에 삽입하여 주로 단일 가온을 선택적으로 모공을 형성하는 데 30-60분을 허용합니다. 멤브레인 테스트 기능을 통해 기가 씰을 계속 모니터링합니다. 패치 천공이 최적일 때, 앰프의 세포 정전 용량 및 계열 저항을 위한 다이얼을 조정하여 커패시턴스 과도를 취소합니다.
안정적인 전압 단계 양이온 전류가 관찰되면 원고에 설명된 대로 라우팅 전압 단계 프로토콜로 전류를 기록합니다. 화합물 또는 생리적 시험 상태를 적용하여 슈퍼퓨전으로 테스트하고 세척뿐만 아니라 대조군 및 시험 조건에 대한 반응을 기록한다. 이 프로토콜은 기능 및 분자 연구를 위해 건강하고 신선한 DSM 세포를 격리하는 데 사용할 수 있습니다.
건강한 단일 DSM 세포는 현미경으로 볼 때 스핀들 모양의 형태, 선명한 잘 정의된 가장자리, 세포 주위의 잘 정의된 후광 및 반 수축 외관을 특징으로 합니다. 더욱이, 갓 분리된 DSM 세포는 기계적 자극과 카바콜에 반응한다. 후속 패치 클램프 실험에서는 세포 단편 및 실행 불가능한 또는 과다소화 셀을 피해야 합니다.
절연 된 세포는 전세포 전류가 3 개의 다른 인간 DSM 세포에서 유도 된 전압 단계 또는 램프 프로토콜로 측정 된 amphotericin-B 천공 패치 클램프 실험에 사용되었습니다. 실험에 따르면 TRPM4 채널 억제제인 9-페난트롤은 인간 DSM 양이온 전류를 효과적이고 가역적으로 억제했다. 9-페난트롤에 민감한 전류 성분은 양전압과 바깥쪽 정류에서 더 강한 억제를 보여줍니다.
효소 치료 단계의 조건, 단계 2.2 및 2.3, 온도 포함, 효소 치료의 기간, 효소 로트 소스 및 DSM 세포의 품질, 고품질 인간 DSM 세포를 얻기위한 주요 결정 요인입니다. 인간 DSM 세포는 또한 칼슘과 순환 AMP를 포함한 세포 내 제2 메신저 수준을 평가하고, 면역 세포화학에 의한 단백질 발현을 감지하고, RT-PCR, qRT-PCR, 마이크로어레이 및 차세대 염기서열에 의한 상근 소송 분석 및 mRNA 발현에 의한 공동 발현을 평가하는 데 이상적입니다. 인간 DSM 세포는 오줌 방광에 있는 BK, 칼슘, TRPM4 채널의 역할에 대한 우리의 이해를 발전시켰습니다.
향후 개발은 전사 또는 프로테오메 프로파일과 전기 생리학적 또는 약리학적 특성을 구체적으로 연결할 수 있게 합니다.
