Las células musculares lisas de Detrusor forman la pared de la vejiga urinaria que, en última instancia, facilita el vaciado y almacenamiento de la orina. Nuestro protocolo proporciona un método validado y confiable para el aislamiento recién aislado de células musculares lisas individuales. Las células musculares lisas descamsores humanos recién aisladas proporcionan una oportunidad para exámenes electrofisiológicos y moleculares a nivel de una sola célula.
Al estudiar células musculares lisas de detrusor único de control, vejigas urinarias humanas normales y enfermas, tenemos la oportunidad de validar dianas farmacológicas como canales iónicos. Las células musculares lisas de detrusores humanos individuales son ideales para experimentos electrofisiológicos como la electrofisiología de la abrazadera de parches. Aquí presentaremos un ejemplo de estudio de un solo canal iónico llamado TRPM4, receptor transitorio potencial melastatin cuatro canales, que es un canal catiónico no selectivo.
Los principiantes pueden tener problemas con la disección y los pasos de tratamiento enzimático que requieren eficiencia y familiaridad, incluyendo el reconocimiento de pasos importantes críticos para obtener células DSM aisladas frescas. Es importante estar familiarizado con la histología de la vejiga humana, los pasos de protocolo para aislar las células individuales siguen siendo resistentes e inicialmente esperar obtener células subóptimas usando este protocolo. Comience examinando la muestra de vejiga urinaria de espesor completo.
Ancle la muestra, la mucosa hacia arriba y la serosa hacia abajo sobre un plato redondo recubierto de enantiómero de silicona de 150 mm lleno de DS helado y retire cuidadosamente toda la mucosa mediante una disección aguda. Corte varias piezas de músculo liso sin mucosas o piezas de DSM. Coloque de tres a seis piezas de DSM en un tubo con uno o dos mililitros de DS precalentado que contengan papaína y ditiotrotiol, o DS-P.
Incubarlos a 37 grados centígrados durante 30 a 45 minutos, asegurándose de agitar el tubo cada 10 a 15 minutos. Después de la incubación, retire el DS-P del tubo y lave brevemente las piezas de DSM con DS helada. Transfiera el DS con piezas de DSM a un tubo nuevo y retire el DS, dejando las piezas DSM en la parte inferior del tubo. Agregue de uno a dos mililitros de DS que contengan colagenasa tipo II, o DS-C, al tubo.
Y incubarlo a 37 grados centígrados con temblores ocasionales. Deseche el DS-C y lave las piezas de DSM tratadas enzimáticas de cinco a 10 veces con DS helada. Después del último lavado deje el DS dentro del tubo, y suavemente triturar las piezas con una pipeta Pasteur pulida al fuego para liberar células DSM individuales. Pipetear 0,25 a un mililitro de suspensión celular sobre una cámara inferior de vidrio situada en el escenario de un microscopio invertido e incubarlo durante al menos 45 minutos para permitir que las células se adhieran.
A continuación, retire el DS del baño y reemplácelo por la solución E a través de la superfusión. Tire de múltiples electrodos de parche, pula las puntas de los electrodos y cubra las puntas en cera dental si es necesario. Llene la punta de un electrodo de parche con la solución de pipeta sin anfotericina-B sumergiendo brevemente el electrodo en la solución.
El éxito de la electrofisiología de la abrazadera de parche depende de la calidad de la célula DSM y de la solubilización de la anfotericina B. Rellene el electrodo con la misma solución de pipeta que contenga anfotericina-B y monte el electrodo en un soporte conectado a una etapa del cabezal del amplificador de abrazadera de parche. Utilice un micromaniprógrafo para colocar el electrodo justo debajo de la superficie de la solución extracelular de modo que la punta del electrodo quede sumergida.
A continuación, determine la resistencia del electrodo utilizando la función de ventana de prueba de membrana del software de adquisición comercial y avance el electrodo hacia la célula de interés. Al tocar la superficie celular con el electrodo, forme un giga-sello aplicando una suave presión negativa rápida al electrodo a través del tubo. Esto da lugar a una presión negativa en la punta del electrodo, lo que resulta en un microsellado exitoso, según lo confirmado por la prueba de membrana.
Espere de 30 a 60 minutos para que la anfotericina-B difunda la pipeta y se inserte en la membrana plasmática, formando poros principalmente selectivos a cationes monovalentes. Continúe monitoreando el giga-sello con la función de prueba de membrana. Cuando la perforación del parche sea óptima, cancele los transitorios de capacitancia ajustando los diales para la capacitancia celular y la resistencia en serie en el amplificador.
Una vez observadas las corrientes de catión de paso de voltaje estables, registre las corrientes con el protocolo de paso de voltaje de ruteo como se describe en el manuscrito. Aplicar un compuesto o una condición de prueba fisiológica para probar por superfusión y registrar las respuestas para las condiciones de control y prueba, así como el lavado. Este protocolo se puede utilizar para aislar células DSM frescas y saludables para estudios funcionales y moleculares.
Las células DSM individuales sanas se caracterizan por morfología en forma de husillo, bordes nítidos bien definidos, un halo bien definido alrededor de la célula y apariencia semiconfular cuando se ven bajo el microscopio. Además, las células DSM recién aisladas responden a la estimulación mecánica y al carbachol. Los fragmentos de células y las células no viables o sobreexgeridas deben evitarse en los experimentos posteriores de la abrazadera de parches.
Las células aisladas se han utilizado en experimentos de abrazadera de parche perforado anfotericina-B donde las corrientes de células enteras se midieron con un protocolo de rampa o inducido por un paso de tensión en tres células DSM humanas diferentes. Los experimentos revelaron que 9-fenanthrol, un inhibidor del canal TRPM4, inhibió de manera efectiva y reversible las corrientes de catión de DSM humano. El componente de corriente sensible al 9-fenanthrol ilustra una inhibición más fuerte en tensiones positivas y rectificación hacia afuera.
Condición de los pasos de tratamiento enzimático, pasos 2.2 y 2.3, incluyendo la temperatura, la duración de los tratamientos enzimáticos, las fuentes de lotes enzimáticos y la calidad de las células DSM, son determinantes clave para obtener células DSM humanas de alta calidad. Las células DSM humanas también son ideales para evaluar los niveles de segundo mensajero intracelular, incluyendo calcio y AMP cíclico, la detección de expresiones proteicas por inmunocitoquímica, y la coexpresión mediante ensayos de litigios proximales in situ, y la expresión de ARNm por RT-PCR, qRT-PCR, microarrays y secuenciación de próxima generación. Las células DSM humanas han avanzado nuestra comprensión de las funciones de los canales BK, calcio, TRPM4 en la vejiga urinaria.
Los desarrollos futuros permitirán vincular específicamente las propiedades electrofisiológicas o farmacológicas con los perfiles de transcriptoma o proteoma.
