Células musculares lisas destrusor formam a parede da bexiga urinária que, em última análise, facilita o vazio e armazenamento da urina. Nosso protocolo fornece um método validado e confiável para o isolamento recente de células musculares suaves. Células musculares lisas destrusor humanos recém-isoladas fornecem uma oportunidade para exames eletrofisiológicos e moleculares em nível único celular.
Ao estudar células musculares lisas de controle, normais e doentes, temos a oportunidade de validar alvos farmacológicos, como canais de íons. Células musculares lisas de detrusor humanos únicos são ideais para experimentos eletrofisiológicos, como eletrofisiologia de grampo de remendo. Aqui apresentaremos um exemplo de estudo de um único canal de íons chamado TRPM4, receptor transitório potencial melastatina quatro canal, que é um canal de cáção não seletivo.
Os novatos podem lutar com a dissecção e as etapas de tratamento enzimática que requerem eficiência e familiaridade, incluindo o reconhecimento de passos importantes críticos para a obtenção de células DSM isoladas frescas. É importante estar familiarizado com a histologia da bexiga humana, as etapas de protocolo para isolar células únicas permanecem resilientes, e inicialmente esperam obter células subótimas usando este protocolo. Comece examinando toda a espessura da bexiga urinária.
Fixar o espécime, mucosa voltada para cima e serosa para baixo em um prato redondo revestido de 150 mm revestido de silicone enantiomer cheio de DS gelado e remover cuidadosamente toda a mucosa por dissecção afiada. Corte vários músculos lisos ou músculos DSM sem mucosa. Coloque de três a seis peças de DSM em um tubo com um a dois mililitros de DS pré-aquecidos contendo papain e dithiothreitol, ou DS-P.
Incubar-os a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos, certificando-se de agitar o tubo a cada 10 a 15 minutos. Após a incubação, remova o DS-P do tubo e lave brevemente as peças de DSM com DSM gelado. Transfira o DS com peças DSM para um novo tubo e remova o DS, deixando as peças do DSM na parte inferior do tubo. Adicione um a dois mililitros de DS contendo colagenase tipo II, ou DS-C, ao tubo.
E incuba-lo a 37 graus Celsius com agitação ocasional. Descarte o DS-C e lave as peças DSM tratadas com enzimas de cinco a dez vezes com DS gelado. Após a última lavagem deixe o DS dentro do tubo, e triturar suavemente as peças com uma pipeta Pasteur polida a fogo para liberar células DSM únicas. Pipeta 0,25 a um mililitro de suspensão celular em uma câmara inferior de vidro sentada no palco de um microscópio invertido e incuba-lo por pelo menos 45 minutos para permitir que as células aderam.
Em seguida, remova o DS do banho e substitua-o por solução E via superfusão. Puxe vários eletrodos de remendo, polir as pontas do eletrodo e cubra as pontas em cera dentária, se necessário. Encha a ponta de um eletrodo de remendo com a solução de pipeta sem anfotericina-B, mergulhando brevemente o eletrodo na solução.
O sucesso da eletrofisiologia do grampo depende da qualidade celular DSM e da solubilização da aforotericina-B. Enchimento do eletrodo com a mesma solução de pipeta contendo anfotericina-B e monte o eletrodo em um suporte conectado a um estágio de cabeça do amplificador de remendo. Use um micromanipulador para colocar o eletrodo logo abaixo da superfície da solução extracelular para que a ponta do eletrodo fique apenas submersa.
Em seguida, determine a resistência ao eletrodo usando a função da janela de teste de membrana do software de aquisição comercial e avance o eletrodo em direção à célula de interesse. Ao tocar a superfície celular com o eletrodo, forme uma vedação giga aplicando uma pressão negativa rápida suave ao eletrodo através de tubos. Isso resulta em pressão negativa na ponta do eletrodo resultando em um giga-seal bem sucedido, conforme confirmado pelo teste de membrana.
Permita que 30 a 60 minutos para que a anfotericina-B difunda a pipeta e seja inserida na membrana plasmática, formando poros principalmente seletivos para cáações monovalentes. Continue monitorando o selo giga com a função de teste de membrana. Quando a perfuração do patch estiver ótima, cancele os transitórios de capacitância ajustando os mostradores para capacitância celular e resistência à série no amplificador.
Uma vez observadas as correntes de cation de etapa de tensão estável, regiso com o protocolo de passo de tensão de roteamento, conforme descrito no manuscrito. Aplique um composto ou uma condição de teste fisiológico para testar por superfusão e regise as respostas para as condições de controle e teste, bem como a lavagem. Este protocolo pode ser usado para isolar células DSM saudáveis e frescas para estudos funcionais e moleculares.
As células de DSM individuais saudáveis são caracterizadas pela morfologia em forma de fuso, bordas bem definidas, um halo bem definido ao redor da célula e aparência semicontícil quando vista sob o microscópio. Além disso, as células DSM recém-isoladas respondem à estimulação mecânica e ao carbachol. Fragmentos celulares e células não viáveis ou super digeridas devem ser evitados em experimentos subsequentes de grampo de remendo.
As células isoladas têm sido usadas em experimentos perfurados de grampo perfurado por anfotericina B, onde as correntes de células inteiras foram medidas com um protocolo de passo de tensão induzido ou rampa em três células DSM humanas diferentes. Experimentos revelaram que o 9-phenanthrol, um inibidor do canal TRPM4, inibiu efetivamente e reversivelmente as correntes de cáção de DSM humanas. O componente de corrente sensível ao 9-fenotirol ilustra uma inibição mais forte em tensões positivas e retificação externa.
Condição de etapas de tratamento enzimático, etapas 2.2 e 2.3, incluindo temperatura, duração de tratamentos enzimáticos, fontes de lote enzimático e qualidade das células DSM, são determinantes fundamentais para a obtenção de células DSM humanas de alta qualidade. As células DSM humanas também são idealmente adequadas para avaliar os níveis intracelulares do segundo mensageiro, incluindo cálcio e AMP cíclico, detecção de expressões proteicas por imunocitoquímica e co-expressão por ensaio de litígio proximal in situ, e expressão mRNA por RT-PCR, qRT-PCR, microarrays e sequenciamento de próxima geração. As células DSM humanas avançaram nossa compreensão dos papéis dos canais BK, cálcio, TRPM4 na bexiga urinária.
Desenvolvimentos futuros permitirão vincular especificamente propriedades eletrofisiológicas ou farmacológicas com os perfis transcriptome ou proteome.
