双DNA标尺测定可以为核糖体易位提供机械见解，并探寻其他核酸位移。我们的双DNA标尺测定是目前唯一能够客观地探测核糖体复合物中mRNA入口和出口两侧的单核苷酸分辨率的方法。类似的方法也用于测量化疗药物的DNA结合强度和选择性。
该方法的可视化演示是我们直观地展示我们技术优势并帮助其他研究人员进一步开发到更多应用中的好机会。首先，在中心钻一个尺寸为四毫米、三毫米、两毫米的立方体，用苯乙烯带制作塑料样品井。然后，使用环氧树脂，将一块长约五毫米的生物素涂层玻璃粘在底部表面。
将20微升，每毫升0.25毫克水溶液加入样品中，在室温下孵育40分钟。然后用TAM10缓冲液冲洗样品两次。要固定在没有抗生素的核糖体复合物上，首先从样品井中去除缓冲液，并在样品井中加入20微升0.1微摩尔MF-Pre或MF-后核糖复合物。
在37摄氏度下孵育一小时，然后用TAM10缓冲液冲洗一次。核糖体复合物现在通过mRNA上的五主要端生物素与表面的链球菌结合。在使用抗生素的实验中，用一微升4毫摩尔新霉素，37摄氏度，孵育9微升的MF-Pre复合物，10分钟。
然后结合在管 0.6 微升 60 微摩尔 EFG， 0.8 微升 100 微摩尔 GTP、0.8 微升 100 毫摩尔 PEP、0.3 微升每毫升丙酮酸激酶 1.3 毫克、6.43 微升 TAM10 缓冲液和 1 微升 5 毫摩尔富西酸。在37摄氏度下孵育20分钟。然后将两种混合物混合，在37摄氏度下孵育5分钟。
进行其他抗生素实验类似，浓度为0.2毫摩尔维奥霉素、0.4毫摩尔湿霉素B和0.25毫摩尔富西酸。对于帧移位研究，重复用于涉及滑滑图案 U6A 的 MFNF-Pre 复合物的孵化。包括富西酸和新霉素的抗生素。
需要足够的时间来确保混合过程的完成。还建议使用TAM10缓冲液与实际一摩尔氯化钠来维持一个均匀系统。孵育后，从样品井中去除缓冲液。
加入20微升的一微摩尔生物基化探测DNA链，并在室温下孵育过夜。早晨，用TAM10缓冲液冲洗一次成形的DNA/mRNA双工。从样品井中拆下缓冲液。
然后将20微升，每毫升0.5毫克，在样品中加入0.5毫克的石丁涂层磁珠，并在室温下孵育两小时。之后，小心地将样品插入支架中，并将其放入离心机中，以 84 倍 g 的电流从表面清除自由磁性颗粒五分钟。打开激光。
然后按下电源按钮。将灵敏度调整到 500 毫伏，等待约两个小时以预热和稳定原子磁力计。要设置原子磁力计，请运行仪器控制软件，将电机移动模式设置为"噪音"，将默认位置设置为零。
按前面板上的锁。将灵敏度调整回 200 毫伏。调整激光的电流和电压，找到适当的谐振峰值和信噪比电平，以获得最佳信号分辨率。
按前面板上的"扫描"。确保振幅宽度比高于 0.5，相位值小于宽度小于 170 赫兹的 5 度。将另一个 SR530 锁定放大器的输出插入激光器的反馈以锁定其频率。
插入功能发生器 ATF20B，输入 500 毫伏峰值的方波峰值，100 毫赫作为将电流转换为磁性信号的参考信号。然后拔下功能发生器。将电机移动模式设置为双向，将默认位置设置为 260 毫米。
检查原子传感器的温度控制器的状态，以确保温度在 37 摄氏度左右。直接运行程序，无需加载样品即可测量空样品支架的信号，检查整个系统的稳定性两次。要磁化样品，请轻轻使用钳子将样品从支架中取出，并在磁化阶段放置两分钟。
然后将样品放回样品架中，以335.4倍g离心20分钟。去除非特异性磁性颗粒。接下来，用钳子将样品装到电机上。
单击"锁定"前面板以运行程序。同时，使用钳子将另一个样品装入支架中，然后放入离心机。使涂层玻璃面朝向离心机的中心，以 335.4 倍 g 启动离心 4 分钟。
当电机返回零时，大约五分钟后，单击"前面板上的保存"。小心地使用钳子将一个样品从电机转移到离心机支架上。通过将离心速度提高 100 rpm 或类似步长来施加更强的力。
将样品交换到离心机。交替处理，每次逐渐增加力。在 10 到 12 个数据点后获得完整的力谱。
完成所有计划的实验后，关闭设备，按相反的顺序运行，因为它已打开。从支架中取出样品，并将其浸入乙醇中，用于清洁和将来使用。在磁珠污染的情况下，用丙酮清洁样品架。
在此协议中，核糖体复合物通过mRNA的五个底端固定在表面，使探测DNA标尺的五等和三等面都易于接近。当五个底端的连链接器超过50胸腺素时，检测到强磁信号，表明DNA/mRNA双面的成功形成。通过改变DNA上的核苷酸数量，分别实现了三等和五等面分离力与双面长度的相关性。
在没有抗生素的情况下，从MF-Pre到MF-Post的正常移位结果表明，核糖体由三个核苷酸向两侧的三个主要端移动。MF-Pre分别携带了一个流浪的fMet-tRNA和苯丙氨酸-tRNA，而MF-Post在E和P站点分别携带了fMet-tRNA和苯丙氨酸-tRNA，并空出的一个 A站点。然而，当富西迪奇酸和二恶英抗生素都存在时，核糖体在五主要侧只移动一个核苷酸，而在三质一侧只移动两个核苷酸。
洗掉抗生素后，正常易位发生，五等和三等两侧的三个核苷酸运动就证明。磁化样品时，涂层表面应接近并垂直离开磁铁。去除非特异性磁性粒子对数据的准确性和质量非常重要。
我们的技术为研究核酸的分子位移提供了高分辨率和普遍适用的方法，这种位移在分子生物学中是广泛遇到的。
