以下方法文章的总体目标是展示一种方案，该方案可用于使用光学镊子结合共聚焦显微镜研究RNA与蛋白质或其他因子的相互作用。在过去的十年中，已经开发了几种复杂的技术来研究单个大分子的性质。其中一种技术是单分子光学镊子。
使用新的荧光辅助光学镊子，不仅可以详细监测RNA分子展开所需的力以及翻译过程中的结合事件。在这里，我们专注于RNA分子在有和没有调节翻译的交易因子的情况下被拉伸的测量。我们还说明了如何将该技术应用于使用标记的核糖体监测翻译。
该协议将由我小组中的两名研究生Lukas Pekarek和Stefan Park演示。在本视频中，我们将指导您完成光学镊子实验的设置和执行。我们还概述了简单的数据分析工作流程。
这种技术的优点是它简单而强大。分子被拴在两个珠子之间，绑在激光束的焦点中，在所谓的力斜坡实验中可以精确地测量位移时的变化和力。系绳内部的二级结构根据分子的内部能量以一定的力展开。
多个结构之间的这种动态转变可以通过恒力测量进一步研究。此外，荧光成像的并行使用可用于实时可视化结合事件。在绑定影响其稳定性的潜在交易因素后，系绳的不同力-距离分布可能会有所不同。
首先，必须将感兴趣的RNA克隆到DNA载体中。该序列的上游和下游，需要额外的部分，手柄来将最终的DNA-RNA构建体拴在珠子之间。在质粒成功克隆和扩增后，进行三种不同的PCR反应。
对于每个PCR反应，根据方案中的表一混合试剂。在适当的热循环仪中以50微升等分试样运行PCR。第一个导致整个构建体的双链DNA与T7启动子，用于随后的体外转录。
第二个PCR产生五个质控手柄。而最后的反应导致三个素数手柄。5 个定焦手柄和 3 个定焦手柄都需要根据使用的珠子进行标记。
在PCR期间，使用标记的地高辛反向引物标记三个质代手柄，并且必须通过生物素化在额外的步骤中标记五个质控手柄。使用T 40和聚合酶进行五个质性手柄的三个质数生物素化。反应在室温下进行一至两小时。
接下来，使用T7聚合酶进行体外转录。根据RNA的长度，在37度下孵育反应两到四个小时。在最后一步中，用体外转录的RNA退火手柄，以获得具有双链手柄之间单链目标区域的最终DNA-RNA构建体。
要退火所需的RNA-DNA杂交种，请在退火缓冲液中混合手柄和RNA。加热，将混合物退火至85度持续10分钟，然后缓慢冷却至样品4度。将退火样品与体积的1/10的三摩尔乙酸钠和三体积的冰冷乙醇混合，并在零下80度下孵育至少一小时。
将样品以15， 000 xg在四度下离心30分钟。弃去上清液并在真空下干燥沉淀。重悬沉淀的小等分试样在液氮中冷冻并保持在零下80度，直到使用。
首先从注射器中取出漂白剂，并填充一毫升不含RNase的水。加入50微升0.5摩尔硫代硫酸钠，并用一巴洗涤系统。请注意，微流体系统永远不会干涸，以避免系统中出现气泡。
接下来，丢弃剩余的硫代硫酸钠溶液，并用新的注射器替换注射器。然后用至少0.5毫升RNase游离水再次洗涤。要设置机器的光学系统，请将两滴浸油滴到物镜上。
将流通池放置到位并升起物镜，直到液体接触到流通池。然后将两滴浸油滴在流通池的顶部。现在打开陷阱转向装置和陷阱激光器。
使用机器诊断摄像头的Z形查找器工具调整物镜。通过转动微型螺钉，Z轴被调整到第二和第三反射之间的腔室中间。其中折射环最大。
将诊断摄像头切换到月球模式，将捕获激光降低到50%左右，然后降低聚光镜并调整其位置，以便您看到大约10个光带。测量室有五个通道，在实验之前，应考虑不同的设置可能性。对于简单的力斜坡实验，磁珠-缓冲-磁珠是一种方便的通道排列。
对于第四种化合物的测量，如荧光核糖体或交易因子，珠子 - 珠子 - 缓冲因子是更好的排列，但它使捕获珠子变得更加困难。将等分试样与3微升AD珠悬浮液，1微升RNase抑制剂和8微升测定缓冲液在室温下孵育10至20分钟。然后将样品稀释在500微升测定缓冲液中并放入相应的通道中。
对于第二种微球，将0.8微升测定微球与一mL测定缓冲液混合并施用到相应的通道中。通道打开并用低压清洗。现在打开陷印激光。
为了捕捉珠子，激光器彼此分开移动，AD珠子被捕获在陷阱中。接下来，阶段被移动到SA珠道，珠子被困在陷阱二中。为了避免丢失磁珠，或在同一陷阱中捕获第二个磁珠，将载物台移动到缓冲通道并关闭所有通道。
在缓冲液中，执行陷阱校准。捕获的珠子应设置为可视模板，以便后续测量。并且测量之间的相似性分数应保持在90%以上，以保证可比性。
最后，珠子靠得更近，人们可以开始捕捉一根绳子。这是将珠子关闭几秒钟，然后再次缓慢离开珠子。系绳形成导致在将两颗珠子彼此拉开时测量的力增加。
通过找到过度拉伸的平台，并将轨迹与自由连接的链条或蠕虫状链模型进行比较，可以检查系绳的数量和质量。对于单个系绳，过度拉伸的高原应在50至60皮波尼顿之间。要进行荧光测量，请打开单元和光学镊子机上的共聚焦激光器和光子计数。
之后，打开所需波长的激发激光器和软件界面，根据荧光团将激光器的功率设置为5%或更高。现在，可以使用软件的图像或运动记录仪功能启动成像。为了获得聚焦良好的图像，请确保共聚焦显微镜和光学陷阱的焦平面对齐。
为此，可以采用蓝色激光通道中聚苯乙烯微球的自发荧光。随着光学陷阱的焦平面上下移动，直到磁珠的自发荧光达到其最高直径。在这个位置，可以检测到在系留分子处发生的荧光信号。
对于这两个功能，选择适当的感兴趣区域非常重要。在整个测量过程中，可以通过将微珠移动到不同的通道或通过改变微流体系统中提供的缓冲液来轻松更改缓冲液组合物。为避免光漂白，在未测量时始终关闭激发激光。
器件输出的原始数据通常包含大量噪声。因此，为了进一步分析分散的数据，首先必须对其进行预处理。第一步是用低通巴特沃斯滤波对数据进行下采样和滤波，得到良好的结果。
对于力斜坡实验，必须在第一距离曲线的相应折叠和展开区域标记展开事件，可以使用蠕虫状链或自由连接链模型进行拟合。对于恒定力数据，可以绘制随时间变化的距离，并且生成直方图以量化给定力下的主要构象非常有用。这里表明，滤波器参数对于区分不同的折叠状态至关重要。
为了更好地理解使用这种技术可以实现的目标，显示了一些具有代表性的结果。这就是力斜坡实验的标准力-距离曲线的样子。在这种情况下，我们研究了SARS-coronavirus-2帧移位元件。
我们观察到在15皮波顿附近以多个步骤展开。当方向反转并且珠子再次靠近时，系绳会以略低的力重新折返。当我们在锌指抗病毒蛋白ZAP的存在下测量相同的RNA时，观察到类似的展开模式。
但RNA的二级结构没有重新折叠。这是一个很好的例子，可以说明蛋白质结合对RNA动力学有多大影响。查看恒定力数据，可以进一步研究展开的动力学。
绘制不同力随时间变化的距离，并在右侧添加不同观测状态的直方图。在10皮牛顿时，RNA完全处于折叠状态。在11.5皮波顿时，它在状态之间切换，而在13皮波顿时，RNA永久处于未折叠状态。
然而，当SARS-冠状病毒-2帧移位元件与ZAP一起测量时，RNA在11皮波顿时完全处于展开状态，甚至在10皮波顿时向折叠状态过渡很少。这表明ZAP与单股框架移位元件结合并阻止了二级结构的形成。最后，我们将看看一些光学镊子数据以及共聚焦显微镜。
在该实验中，使用荧光染料标记双链核酸，而不是特异性地以增加的力。运动记录仪显示，当珠子彼此分开移动时，荧光强度增加，一旦系绳拉伸过度并断裂，它就会完全消失。在最后一张图中，荧光标记的核糖体通过第四通道加入。
在该实验中观察到特异性核糖体与RNA系绳的结合。我们希望这个视频能让您深入了解光学镊子以及这种令人难以置信的技术可以执行什么。
