皮质醇从鱼翅和爪骨基质提取

我们的方法引入了一种新的替代应力指标，它可以成为未来许多研究的平台，用于测量新的非绘图和头发基质中的皮质醇。这种技术的优点是它的简单性，它的能力，用于评估压力水平，即使在屠宰的动物。使用这种技术建立高皮质醇水平与健康动物或人类之间的关系有助于诊断某些疾病。

此方法还可用于研究数百年前的生物样本，如这些老化石，以评估样本寿命内的压力水平。对于皮质醇提取，在将样品放入单独的 15 毫升锥形管之前，在数字分析刻度上以 0.0001 的精度称出每个样品的 300 正负 10 毫克。在每个样品管中加入三毫升异丙醇，每分钟旋转管80圈2.5分钟，洗净皮质醇，消除任何潜在的外部污染。

上次洗涤后，在室温下空气干燥样品七天，然后再次清洗样品三次，如每次洗涤使用新鲜的超纯水。称出 75 正负 5 毫克干鳍或下颚骨样品，并使用珠打手以 50 赫兹最后研磨样品 32 分钟。然后，将1.5毫升甲醇送到每管粉鳍或下颚骨上，并在室温下以每分钟40次旋转将样品放在管旋转器上，18小时。

皮质醇提取后，通过离心沉淀样品组织。将顶部一毫升的黄色有机皮质醇从每个样品中转移到单独的1.5毫升微离心管中。将皮质醇样品在38摄氏度的烟罩中干燥过夜，以蒸发甲醇。

第二天早上，在每个管和涡流中加入400微升PBS，并离心样品收集皮质醇。对于 ELISA 分析，将每个提取的标准皮质醇样品的 25 微升加载，并重复控制到 96 孔 ELISA 板的适当孔中。将25微升的测定稀释剂装入两个孔中，作为零和每个非特异性结合井。

将15微升酶结合剂与24毫升的解液混合，并在每孔中加入200微升的联结剂。在旋转器上混合板五分钟，每分钟旋转 500 次。随后在室温下孵育一小时。

在孵育结束时，用300微升的1x洗涤缓冲液每井洗盘四次。每次洗涤后，快速将盘子倒置在水槽上，丢弃缓冲液，将盘子印在一叠纸巾上。上次洗涤后，将 200 微升 TMB 基板溶液添加到每一个井中，然后以每分钟 500 次旋转的速度将板放在旋转器上 5 分钟。

混合后，在室温下孵育板25分钟，防止光线。在孵化结束时，在每一个井中加入50微升的止动液。在旋转器上混合板内板内容物三分钟，每分钟旋转 500 次，或直到所有孔从绿色变成黄色。

然后，读取样品的光学密度，并使用微板软件将每个样品中的皮质醇水平转换为每毫克的象形图。在这个具有代表性的分析中，用异丙醇洗涤的鳍样本中皮质醇水平往往高于用水洗涤的鱼翅样本，但在鱼种中未观察到鳍皮质醇水平的显著差异。洗涤溶剂和鱼种之间没有显著的相互作用。

从H.Huso下颚骨检查皮质醇，以确定鱼爪骨是否可以用作鳍的替代基质，发现洗涤溶剂对H.Huso的鱼尾鱼测量的皮质醇水平没有显著影响。此外，数据表明，在三种被测试的鱼翅和H.Huso下颚骨中，鱼翅非常相似。使用珠子打手将样品研磨成细粉，并使用适当的商业 ELISA 检测试剂盒进行成功的皮质醇测量非常重要。

此方法还可用于检测牙齿和其他硬基质中的皮质醇，因为皮质醇水平测量提供了有关环境如何影响动物生物学的重要信息。该方法可作为评估人类儿童乳牙和儿科内分泌学、心理生物学、行为学、考古学和法医研究皮质醇水平的新方法。