这是一种评估考拉毛皮中的糖皮质激素皮质醇的新方法。它为考拉慢性压力的评估提供了一种新颖的生物标志物。这项技术的主要优点是，它是一种高度敏感和可重复的方法，在样品制备和激素测定之间有相当快的周转时间。
该技术允许对考拉的慢性应激进行定量评估，这是一种非常有用的临床管理工具。帮我做这个程序的是迪伦福克斯，一个研究生，从我的实验室。开始此过程，在零下 80 摄氏度的储存中取回毛皮，并在室温下解冻。
然后，在实验室分析精度平衡上称压毛皮。将60毫克的毛皮放入预称并标有1.5毫升离心管中，然后重复，直到18根管子被填充。使用移液器，向每个管中加入一毫升 100%HPLC 级异丙醇。
旋转样品30秒。用0.5毫升微精密筛对每个样品进行应变，以实现液体和毛皮的分离，将液体丢弃到废物容器中。将每个毛皮样品放入标有塑料称重的船上。
然后将称重船放入真空干燥器中，离开三天，让毛皮干燥。一旦毛皮完全干燥，将每个样品放入标有 1.5 毫升的微离心管中。将每个样品放在一个带三个铬钢珠的珠子磨机中，以每 30 次摇动/秒的速度粉碎两分钟。
使用 100% 分析级甲醇和 100% 分析级异丙醇重复此转移，直到 18 个总管被填充。在此之后，使用移液器将第一个萃取技术的一毫升转移到六个含有毛皮样品的 1.5 毫升离心管中。盖住每个管子，并使用摇床在室温下孵育，持续脉动至少12小时。
然后用0.5毫升微精密筛对样品进行应变。使用移液器将液体转移到新的标签 1.5 毫升微离心管中，同时确保适当丢弃毛皮。在烟气罩中，在氮气蒸气流下完全尝试溶剂萃取。
然后，用400微升的测定缓冲液和100微升的100%分析级乙醇重新制备干样品。要进行控制，请首先从已知接触压力器的动物中选择样本。要制作一个萃取池，从每个样品中抽取20微升提取物，直到获得200微升的总体积。
将提取物池存放在零下 80 摄氏度，直到准备好运行检测。准备就绪后，从提取物的平行图中获取 30% 和 70% 结合点的稀释因子，然后使用测定缓冲液适当稀释样品池，以创建高和低控制。使用商用皮质醇套件，可根据供应商的指示设置 96 孔带板，包括样品、控制装置、皮质醇标准、非特异性结合井和最大结合井。
使用套件手册中包含的板布局表列出样品、控制和标准的位置。接下来，按照前面描述的毛皮激素提取过程获得100%甲醇提取考拉毛皮。根据制造商的说明准备皮质醇试剂盒。
将 50 微升样品或标准移入板的孔中。将75微升检测缓冲液移入非特异性结合井，将50微升检测缓冲液放入最大结合井。使用中继器移液器将皮质醇结合的25微升添加到每口井中。
然后，移液器25微升的皮质醇抗体进入每口井，除了非特异性结合井。轻轻敲击板的两侧，确保试剂混合良好。用板密封器盖住板，并使用轨道摇床在室温下摇晃一小时。
之后，拆下板密封，用 300 微升洗涤缓冲液清洗每个井，吸气井板。然后用干净的吸水毛巾轻拍盘子来擦干盘子。向每井施用100微升四甲基苯胺基材。
将板密封器放在井板上，在室温下孵育30分钟。在此之后，移液器50微升的停止溶液进入每一个井。将板转移到能够读取 450 纳米的板读器中，并计算文本协议中概述的最终激素浓度。
本研究采用并行性确定感兴趣的激素代谢物的分文检测。在并行曲线上，50%结合点确定标准曲线上的样品稀释系数。可以看到，100%乙醇和100%异丙醇提取物没有提供平行位移对皮质醇标准。
然而，100%甲醇提取物确实提供平行位移对皮质醇标准。所有测定中运行的高结合和低结合样本提取物均确定内部和间变异系数。低绑定内部控制被视为整洁的考拉提取物池，而高绑定内部控制被视为一对二稀释考拉提取物池。
然后使用回归图确定每种溶剂提取物和皮质醇标准之间的关联。与 100%乙醇和 100%异丙醇提取物相比，100%甲醇提取物提供了具有最高 R 平方值的最佳回归线。重要的是要记住，在研磨样品之前必须执行样品洗涤步骤，以避免类固醇激素的流失。
按照这个程序，我们可以测量其他类固醇激素，如生殖激素，看看压力和生殖在考拉之间的相互作用。该技术为新兴保护生理学领域提供了一个新的工具，使考拉毛皮中的皮质醇具有非侵入性评估。商用皮质醇试剂盒提供少量试剂。
然而，在进行这种实验室程序时，必须佩戴个人防护设备，以尽量减少对自身的伤害。
