Unsere Methode führt einen neuartigen alternativen Stressindikator ein, der eine Plattform für zahlreiche zukünftige Studien zur Messung von Cortisol in neuen Nicht-Plot- und Haarmatrizen sein könnte. Die Vorteile dieser Technik sind ihre Einfachheit und ihre Fähigkeit, stresslevel auch bei geschlachteten Tieren zu bewerten. Die Herstellung einer Beziehung zwischen hohen Cortisolspiegel und gesunden Tieren oder Menschen mit dieser Technik kann bei der Diagnose einiger Krankheiten helfen.
Diese Methode kann auch verwendet werden, um jahrhundertealte biologische Proben wie diese alten Fossilien zu untersuchen, um Stressniveaus innerhalb der Probenlebensdauer zu bewerten. Für die Cortisolextraktion 300 plus oder minus 10 Milligramm jeder Probe auf einer digitalen analytischen Skala mit einer Genauigkeit von 0,0001 wiegen, bevor Sie die Proben in einzelne 15 Milliliter konische Röhren legen. Fügen Sie drei Milliliter Isopropanol zu jedem Probenröhrchen hinzu und drehen Sie die Rohre mit 80 Umdrehungen pro Minute für 2,5 Minuten, um das Cortisol auszuwaschen und mögliche äußere Verunreinigungen zu entfernen.
Nach der letzten Wäsche trocknen die Proben sieben Tage lang bei Raumtemperatur, bevor die Proben noch dreimal gewaschen werden, wie mit frischem Ultra-Rindwasser für jede Wäsche demonstriert. Wiegen Sie 75 plus oder minus fünf Milligramm getrocknete Flossen- oder Kieferknochenprobe ab und verwenden Sie einen Perlenschlag, um die Probe schließlich 32 Minuten lang bei 50 Hertz zu mahlen. Dann 1,5 Milliliter Methanol in jedes Rohr der pulverförmigen Flosse oder Kieferknochen liefern und die Proben auf einem Rohrrotator bei 40 Umdrehungen pro Minute für 18 Stunden bei Raumtemperatur platzieren.
Nach der Cortisolextraktion die Probengewebe durch Zentrifugation sedimentieren. Und übertragen Sie den oberen Milliliter der gelblichen, organischen Cortisol-haltigen Schicht aus jeder Probe in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre. Trocknen Sie die Cortisolproben bei 38 Grad Celsius in einer Dunstabzugshaube über Nacht, um das Methanol zu verdampfen.
Am nächsten Morgen 400 Mikroliter PBS zu jedem Röhrchen und Wirbel hinzufügen und zentrifugieren die Proben, um das Cortisol zu sammeln. Für die ELISA-Analyse 25 Mikroliter jeder extrahierten Standard-Cortisolprobe und duplizierte in die entsprechenden Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte. 25 Mikroliter Assay-Verdünnungsstoff in zwei Brunnen laden, um als Null und in jeden unspezifischen Bindungsbrunnen zu dienen.
Mischen Sie 15 Mikroliter Enzymkonjugat mit 24 Milliliter Assay-Verdünnungsmittel und fügen Sie 200 Mikroliter Konjugat zu jedem Brunnen hinzu. Mischen Sie die Platte auf einem Rotator für fünf Minuten bei 500 Umdrehungen pro Minute. Gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation die Platte viermal mit 300 Mikrolitern 1x Waschpuffer pro Brunnen waschen. Schnelles Umkehren der Platte über dem Waschbecken nach jeder Wäsche, um den Puffer zu entsorgen und die Platte auf einem Stapel Papiertücher zu bloten. Nach der letzten Wäsche 200 Mikroliter TMB-Substratlösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte fünf Minuten lang bei 500 Umdrehungen pro Minute auf den Rotator legen.
Nach dem Mischen 25 Minuten lang bei Lichtschutz inkubieren. Am Ende der Inkubation 50 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen. Und mischen Sie den Platteninhalt auf dem Rotator für drei Minuten bei 500 Umdrehungen pro Minute oder bis alle Brunnen von grün zu gelb gedreht sind.
Lesen Sie dann die optische Dichte der Proben und verwenden Sie die Mikroplattensoftware, um die Cortisolspiegel in jeder Probe in Piktogramme pro Milligramm umzuwandeln. In dieser repräsentativen Analyse waren die Cortisolspiegel in Flossenproben, die mit Isopropanol gewaschen wurden, höher als bei denen, die mit Wasser gewaschen wurden, aber bei den Störarten wurden keine signifikanten Unterschiede in den Fin-Cortisol-Spiegeln beobachtet. Es gab keine signifikante Wechselwirkung zwischen Waschmittel und Störarten.
Die Untersuchung von Cortisol aus H.Huso-Kieferknochen, um festzustellen, ob Störkieferknochen als alternative Matrix zu Flossen verwendet werden könnten, ergab, dass das Waschlösungsmittel keine signifikante Wirkung auf den Cortisolspiegel hatte, gemessen in H.Husos Stör. Darüber hinaus zeigten die Daten eine hohe Ähnlichkeit zwischen den Flossen von drei getesteten Störarten und in H.Huso Kieferknochen. Es ist wichtig, den Perlenschlag zu verwenden, um die Proben zu feinem Pulver zu mahlen und ein geeignetes kommerzielles ELISA Assay Kit für eine erfolgreiche Cortisolmessung zu verwenden.
Diese Methode kann auch zum Nachweis von Cortisol in Zähnen und anderen harten Matrizen verwendet werden, da Cortisol-Niveaumessungen wichtige Informationen darüber liefern, wie sich die Umwelt auf die Tierbiologie auswirkt. Die Methode könnte als neuer Ansatz zur Bewertung des Cortisolspiegels in menschlichen Kindermilchzähnen und in pädiatrischen Endokrinologie-, Psychobiologie-, Verhaltens-, archäologischen und forensischen Studien verwendet werden.
