Nosso método introduz um novo indicador alternativo de estresse que pode ser uma plataforma para inúmeros estudos futuros para medir o cortisol em novas matrizes não parcelas e cabelos. As vantagens dessa técnica são sua simplicidade e sua capacidade de ser usado para avaliar os níveis de estresse mesmo em animais abatidos. Estabelecer uma relação entre altos níveis de cortisol e animais saudáveis ou humanos usando essa técnica pode ajudar no diagnóstico de algumas doenças.
Este método também pode ser usado para estudar amostras biológicas centenários, como esses fósseis antigos, para avaliar os níveis de estresse dentro da vida útil da amostra. Para extração de cortisol, pese 300 mais ou menos 10 miligramas de cada amostra em uma escala analítica digital com uma precisão de 0,0001 antes de colocar as amostras em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Adicione três mililitros de isopropanol a cada tubo de amostra e gire os tubos a 80 rotações por minuto durante 2,5 minutos para lavar o cortisol e remover qualquer contaminação externa potencial.
Após a última lavagem, o ar seque as amostras à temperatura ambiente por sete dias antes de lavar as amostras mais três vezes, como demonstrado usando água ultra pura fresca para cada lavagem. Pese 75 mais ou menos cinco miligramas de barbatana seca ou amostra de mandíbula e use um batedor de contas para finalmente moer a amostra a 50 hertz por 32 minutos. Em seguida, entregue 1,5 mililitros de metanol em cada tubo de barbatana em pó ou mandíbula e coloque as amostras em um rotador de tubo a 40 rotações por minuto durante 18 horas em temperatura ambiente.
Após a extração de cortisol, sedimente os tecidos amostrais por centrifugação. E transfira o mililitro superior do cortisol orgânico amarelado contendo camada de cada amostra em tubos microcentrífugas individuais de 1,5 mililitro. Seque as amostras de cortisol a 38 graus Celsius em um capô de fumaça durante a noite para evaporar o metanol.
Na manhã seguinte, adicione 400 microliters de PBS a cada tubo e vórtice e centrífugue as amostras para coletar o cortisol. Para análise ELISA, carregue 25 microlitadores de cada amostra padrão de cortisol extraído e controle em duplicação nos poços apropriados de uma placa ELISA de 96 poços. Carregue 25 microlitres de ensaio diluído em dois poços para servir como zero e em cada poço de ligação não específico.
Misture 15 microlitadores de enzima conjugados com 24 mililitros de diluente assay e adicione 200 microliters de conjugado a cada poço. Misture a placa em um rotador por cinco minutos a 500 rotações por minuto. Seguido de uma incubação de uma hora em temperatura ambiente.
No final da incubação, lave a placa quatro vezes com 300 microliters de 1x Wash Buffer por poço. Invertendo rapidamente a placa sobre a pia após cada lavagem para descartar o tampão e manchando a placa em uma pilha de toalhas de papel. Após a última lavagem, adicione 200 microliters de solução de substrato TMB a cada poço e coloque a placa no rotador por cinco minutos a 500 rotações por minuto.
Após a mistura, incubar a placa por 25 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação, adicione 50 microliters de solução stop a cada poço. E misture o conteúdo da placa no rotador por três minutos a 500 rotações por minuto ou até que todos os poços tenham virado de verde para amarelo.
Em seguida, leia a densidade óptica das amostras e use o software de microplacão para converter os níveis de cortisol em cada amostra em picogramas por miligrama. Nesta análise representativa, os níveis de cortisol tendem a ser mais elevados em amostras de barbatana lavadas com isopropanol do que nas lavadas com água, mas não foram observadas diferenças significativas nos níveis de cortisol na barbatana entre as espécies de esturjão. Não houve interação significativa entre solventes de lavagem e espécies de esturjão.
O exame de cortisol das mandíbulas de H.Huso para determinar se as mandíbulas de esturjão poderiam ser usadas como uma matriz alternativa às barbatanas revelou que o solvente de lavagem não teve nenhum efeito significativo no nível de cortisol medido no esturjão de H.Huso. Além disso, os dados revelaram uma alta semelhança entre as barbatanas de três espécies de esturjão testadas e em mandíbulas H.Huso. É importante usar o batedor de contas para moer as amostras em pó fino e usar um kit comercial de ensaio elisa adequado para uma medição bem sucedida de cortisol.
Este método também pode ser usado para detectar cortisol em dentes e outras matrizes duras, pois as medidas de nível de cortisol fornecem informações importantes sobre como o ambiente afeta a biologia animal. O método poderia ser usado como uma nova abordagem para avaliar os níveis de cortisol nos dentes de leite de crianças humanas e em endocrinologia pediátrica, psico biologia, estudos comportamentais, arqueológicos e forenses.
