우리의 방법은 새로운 비 플롯 및 머리 행렬에서 코티솔을 측정하기위한 수많은 미래 연구를위한 플랫폼이 될 수있는 새로운 대체 스트레스 지표를 소개합니다. 이 기술의 장점은 단순함과 도살 된 동물에서도 스트레스 수준을 평가하는 데 사용할 수있는 능력입니다. 이 기술을 사용하여 높은 코티솔 수준과 건강한 동물 또는 인간 사이의 관계를 확립하는 것은 일부 질병의 진단에 도움이 될 수 있습니다.
이 방법은 또한 견본 수명 내의 응력 수준을 평가하기 위하여 이 오래된 화석과 같은 수백 년 오래된 생물학 견본을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 코티솔 추출의 경우, 개별 15 밀리리터 원모 튜브에 샘플을 배치하기 전에 0.0001 정확도로 디지털 분석 척도에서 각 샘플의 300 플러스 또는 마이너스 10 밀리그램을 무게. 각 샘플 튜브에 3 밀리리터의 이소프로판올을 추가하고 코티솔을 씻어 내고 잠재적인 외부 오염을 제거하기 위해 분당 80 회전에서 튜브를 회전시 2.5 분 동안 회전합니다.
마지막 세척 후, 공기는 각 세척에 대한 신선한 초순수수를 사용하여 입증된 바와 같이 샘플을 세번 더 세척하기 전에 7일 동안 실온에서 샘플을 건조시합니다. 75 플러스 또는 마이너스 5 밀리그램의 말린 지느러미 또는 턱뼈 샘플을 계량하고 비드 비터를 사용하여 32 분 동안 50 hertz에서 샘플을 갈아 드셔 보십니다. 그런 다음, 가루 지느러미 또는 턱뼈의 각 튜브에 메탄올1.5 밀리리터를 전달하고 실온에서 18 시간 동안 분당 40 회전에서 튜브 회전기에 샘플을 배치합니다.
코티솔 추출 후, 원심분리에 의한 샘플 조직을 퇴적시한다. 그리고 각 샘플에서 층을 포함하는 황색, 유기 코티솔의 상단 1 밀리리터를 개별 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 옮킨다. 코티솔 샘플을 밤새 연기 후드에서 섭씨 38도에서 건조하여 메탄올을 증발시다.
다음 날 아침, 각 튜브와 소용돌이에 PBS 의 400 마이크로 리터를 추가하고 코티솔을 수집하기 위해 샘플을 원심 분리합니다. ELISA 분석을 위해 추출된 각 표준 코티솔 샘플25마이크로리터를 96웰 ELISA 플레이트의 적절한 우물에 복제하여 적재합니다. Assay 희석제 25마이크로리터를 두 개의 우물에 로드하여 0으로, 각 비특이적 결합에 잘 작용합니다.
효소 컨쥬게이트 15마이크로리터를 분석 희석제 24밀리리터와 혼합하고 각 우물에 200마이크로리터의 공주를 추가합니다. 분당 500 회전에서 5 분간 회전기에 접시를 섞습니다. 실온에서 1시간 배양이 이어진다.
인큐베이션이 끝나면 잘 1x 워시 버퍼300 마이크로리터로 접시를 네 번 씻으시다. 버퍼를 버리고 종이 타월 더미에 접시를 블롯 한 후 재빨리 접시를 싱크대 위에 반전시다. 마지막 세척 후, TMB 기판 용액 200 마이크로리터를 각 우물에 넣고 분당 500 회전시 5분 동안 접시를 회전기위에 놓습니다.
혼합 후, 빛으로부터 보호실온에서 25 분 동안 접시를 배양. 인큐베이션이 끝나면 각 웰에 50 마이크로리터의 스톱 솔루션을 추가합니다. 그리고 회전기의 플레이트 내용기를 분당 500 회전에서 3분 간 또는 모든 우물이 녹색에서 노란색으로 바뀔 때까지 섞는다.
그런 다음, 샘플의 광학 밀도를 읽고 마이크로 플레이트 소프트웨어를 사용하여 각 샘플의 코티솔 수준을 밀리그램당 피코그램으로 변환합니다. 본 대표적인 분석에서, 코티솔 수치는 물로 세척된 양면 샘플보다 이소프로판올로 세척된 지느러미 샘플에서 더 높은 경향이 있었지만, 유혈구 코티솔 수치에 는 유의한 차이가 철갑상어 종 사이에서 관찰되지 않았다. 세척 용매와 철갑상어 종 사이에는 상당한 상호 작용이 없었습니다.
H.Huso 턱뼈에서 코티솔을 검사하여 철갑상어 턱뼈가 지느러미에 대한 대체 매트릭스로 사용될 수 있는지 여부를 판단하여 세척 용매가 H.Huso의 철갑상어에서 측정된 코티솔 수준에 큰 영향을 미치지 않았다는 것을 밝혀졌습니다. 또한, 데이터는 3개의 철갑상어 종의 지느러미 사이 및 H.Huso 턱뼈에서 높은 유사성을 밝혔습니다. 비드 비터를 사용하여 샘플을 미세 분말로 분쇄하고 코티솔 측정을 위해 적절한 상업용 ELISA 분석 키트를 사용하는 것이 중요합니다.
코티솔 레벨 측정이 환경이 동물 생물학에 미치는 영향에 대한 중요한 정보를 제공하기 때문에 이 방법은 치아 및 기타 단단한 행렬에서 코티솔을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 인간의 아이 우유 치아와 소아 내분비학, 정신 생물학, 행동, 고고학 및 법의학 연구에서 코티솔 수준을 평가하는 새로운 접근법으로 사용될 수 있습니다.
