Nuestro método introduce un nuevo indicador de estrés alternativo que podría ser una plataforma para numerosos estudios futuros para medir el cortisol en nuevas matrices no gráficas y capilares. Las ventajas de esta técnica son su simplicidad y su capacidad para ser utilizado para evaluar los niveles de estrés incluso en animales sacrificados. Establecer una relación entre los altos niveles de cortisol y animales sanos o humanos que utilizan esta técnica puede ayudar con el diagnóstico de algunas enfermedades.
Este método también se puede utilizar para estudiar muestras biológicas centenarias como estos fósiles antiguos para evaluar los niveles de estrés dentro de la vida útil de la muestra. Para la extracción de cortisol, pesar 300 más o menos 10 miligramos de cada muestra en una escala analítica digital con una precisión de 0.0001 antes de colocar las muestras en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Añadir tres mililitros de isopropanol a cada tubo de muestra y girar los tubos a 80 rotaciones por minuto durante 2,5 minutos para lavar el cortisol y eliminar cualquier posible contaminación externa.
Después del último lavado, seque al aire las muestras a temperatura ambiente durante siete días antes de lavar las muestras tres veces más, como se ha demostrado con agua fresca ultra pura para cada lavado. Pesar 75 más o menos cinco miligramos de aleta seca o muestra de mandíbula y utilizar un batidor de cuentas para finalmente moler la muestra a 50 hercios durante 32 minutos. A continuación, entregue 1,5 mililitros de metanol a cada tubo de aleta en polvo o mandíbula y coloque las muestras en un rotador de tubo a 40 rotaciones por minuto durante 18 horas a temperatura ambiente.
Después de la extracción de cortisol, sedimentar los tejidos de la muestra por centrifugación. Y transfiera el primer mililitro del cortisol orgánico amarillento que contiene la capa de cada muestra a tubos micro-centrifugados individuales de 1,5 mililitros. Seque las muestras de cortisol a 38 grados centígrados en una campana de humo durante la noche para evaporar el metanol.
A la mañana siguiente, añadir 400 microlitros de PBS a cada tubo y vórtice y centrifugar las muestras para recoger el cortisol. Para el análisis ELISA, cargue 25 microlitros de cada muestra de cortisol estándar extraída y controle por duplicado en los pozos apropiados de una placa ELISA de 96 pozos. Cargue 25 microlitros de diluyente de ensayo en dos pozos para servir como cero y en cada pozo de unión no específico.
Mezclar 15 microlitros de conjugado enzimático con 24 mililitros de diluyente de ensayo y añadir 200 microlitros de conjugado a cada pozo. Mezcle la placa en un rotador durante cinco minutos a 500 rotaciones por minuto. Seguido de una incubación de una hora a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave la placa cuatro veces con 300 microlitros de 1x Wash Buffer por pozo. Invertir rápidamente el plato sobre el fregadero después de cada lavado para desechar el tampón e hinchar el plato en una pila de toallas de papel. Después del último lavado, agregue 200 microlitros de solución de sustrato TMB a cada pozo y coloque la placa en el rotador durante cinco minutos a 500 rotaciones por minuto.
Después de mezclar, incubar el plato durante 25 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Al final de la incubación, añadir 50 microlitros de solución de parada a cada pocótulo. Y mezcle el contenido de la placa en el rotador durante tres minutos a 500 rotaciones por minuto o hasta que todos los pozos hayan cambiado de verde a amarillo.
A continuación, lea la densidad óptica de las muestras y utilice el software de microplaca para convertir los niveles de cortisol en cada muestra en picogramas por miligramo. En este análisis representativo, los niveles de cortisol tendían a ser más altos en muestras de aleta lavadas con isopropanol que en las lavadas con agua, pero no se observaron diferencias significativas en los niveles de cortisol de aleta entre las especies de esturión. No hubo una interacción significativa entre los disolventes de lavado y las especies de esturión.
El examen de cortisol de H.Huso jawbones para determinar si los maxilares de esturión podrían utilizarse como una matriz alternativa a las aletas reveló que el disolvente de lavado no tuvo ningún efecto significativo en el nivel de cortisol medido en el esturión de H.Huso. Además, los datos revelaron una alta similitud entre las aletas de tres especies de esturión probadas y en las mandíbulas H.Huso. Es importante utilizar el batidor de cuentas para moler las muestras en polvo fino y utilizar un kit de ensayo ELISA comercial adecuado para una medición exitosa de cortisol.
Este método también se puede utilizar para detectar cortisol en dientes y otras matrices duras, ya que las mediciones de nivel de cortisol proporcionan información importante sobre cómo el medio ambiente afecta a la biología animal. El método podría utilizarse como un nuevo enfoque para evaluar los niveles de cortisol en los dientes de leche infantiles y en la endocrinología pediátrica, la biología psicópata, el comportamiento, el arqueológico y los estudios forenses.
