脑膜炎是全世界人口中败血症和脑膜炎最常见的病因之一，细菌仅限于人类宿主。在这项实验协议中，我们将描述在基于细菌的病毒接种的小鼠模型中诱导脑膜炎球菌脑膜炎的定制程序。这个穆林模型再现了脑膜炎球菌性脑膜炎作为一种严重人类疾病的特征病理事件。
因此，它代表了一个有用的工具，以评估宿主-病原体相互作用，并分析导致这种致命疾病的病原体机制。感染模型不仅有助于评估防止细菌直接复制到CSF的创新治疗策略，而且有助于分析可能被动免疫疗法对人类病原体的疗效。该技术要求训练阶段，以确保不仅在治疗性内，但更多的疾病诱导的成功。
演示程序将是罗伯塔·科利奇奥和基亚拉·帕格柳卡作为研究人员，埃琳娜·斯卡廖内作为博士生，所有在我的实验室。首先，从一个新的Neisseria脑膜炎培养在贡球菌加糖板上挑选一个菌落，辅以1%多比妥补充剂，并在10毫升GC Broth中接种。所有涉及使用梅宁球菌的程序必须在层流生物安全立方体柜下完成。
在220 RPM的轨道震动培养箱中，在37摄氏度的温度下生长细菌，并用分光光度计在不同时间点不断检查培养物的光密度。增长培养，直到它达到与早期指数阶段对应的 0.7 的 OD600。一旦获得这种光学密度，通过加入10%甘油和在冷冻瓶中分配1毫升的培养量，使冷冻库存。
将小瓶存放在 80 摄氏度，直到使用。感染前，在室温下解冻冷冻细菌，然后在1500xG下在离心机中转移到离心机管中15分钟，取出上先液，再悬浮在一毫升含有每公斤5毫克的铁脱衣的新鲜GC肉汤下。在开始实验之前，称量动物并评估它们的体温。
从颈部向下擦去动物，用70%乙醇对腹部进行消毒。感染前约2小时，使用25测针，在腹部右下象限内注射铁德xtran。麻醉动物后，通过确认捏住手趾时没有疼痛反应，检查麻醉深度。
将鼠标放在层流柜上后，将其置于胸骨，并小心地伸展四肢和颈椎，以保持椎柱处于直线位置。为了保持一致的细菌悬浮液，在将细菌悬浮液装入注射器中之前，用8毫米30米针轻轻混合。用70%乙醇消毒头部。
将动物放在横向卧式，把耳朵拉出来，适度弯曲颈部。确保颈部和头部的中线与桌面完全平行。然后触摸地图集的翅膀，确保它们重叠，并感觉到针最有可能进入腹孔的中线的自然缩进。
用8毫米30分针填充注射器，用已建立的亚致命细菌剂量的梅宁科奇或铁德斯特兰补充GC Broth作为控制在总体积10微升。使用针头识别注射点，然后通过腹孔将注射器的含量注射到小鼠的 cisterna 磁石中。注射后安全丢弃注射器和针头。
将动物放在笼子的层流柜下。等待觉醒和运动完全恢复，并着手为受感染动物的动物生存，如协议中所述。麻醉小鼠后，用70%乙醇对胸部进行消毒。
使用 25 量针通过胸腔的心脏穿刺提取 600 到 700 微升血液。收集含有3.8%柠檬酸钠的管中的血液，储存在80摄氏度下，以进行以后可行的细菌细胞计数评估。将安乐死鼠标放在超平位置。
用剪刀和钳子沿着身体的下垂平面切割毛皮。用针脚固定皮肤与毛皮在身体的两侧。用锋利的剪刀切掉膜。
然后用剪刀和一次性钳子，切除器官，如脾脏和肝脏，并把它们都放在一个单独的消毒培养皿与一毫升GC汤补充10%甘油。使用五毫米注射器的柱塞，在室温下机械地使器官均质约两到三分钟，直到形成单细胞悬浮液，并将其转移到凹陷的低温小瓶中。立即将管子放在干冰上。
用抗生素制作GC加糖板，在37摄氏度使用前干燥，两到三个小时。从每个均质组织中准备 GC 汤中样品的 10 次完整序列稀释。将它们板在GC阿加板上，在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育过夜。
用70%乙醇，对安乐死小鼠的头部进行消毒。使用小型手术剪刀和细尖的钢钳，切除毛皮和被切除头部的皮肤，然后向头骨顶部走去，以便清楚地看到缝合线并引导颅骨的开口。要打开头骨，请插入小剪刀尖穿过前人巨无霸。
切向颅骨的中心，穿过颅骨的中线，切到头骨的对面，然后沿着羔羊缝合的侧肢轻轻切割。使用细尖钳，从后侧角开始，抬起颅骨，向上拉角，发现大脑，确保脑组织在颅骨被抬起时不会附着在头部的任何骨骼上。使用一次性钳子去除头骨和大脑之间的任何结缔组织，不要让脑组织干涸。
使用一次性钳子立即将大脑放在培养皿中，用一毫升GC肉汤补充10%甘油。使用五毫升注射器的柱塞在室温下机械地使大脑均质约两到三分钟，直到形成单细胞悬浮液。将悬浮液转移到2毫升无菌管中，并在80摄氏度下储存，以进行以后可行的细菌细胞计数评估。
评估了感染93/4286野生型或csA缺陷脑膜炎菌株的小鼠的存活率。野生型菌株的中位致命剂量与脑膜炎球菌挑战10至第4CFU相对应。而死亡率10至第5 CFU等于83.4%和100%，10至5CFU剂量。
为了获得csA缺陷突变菌株的中位致命剂量，需要10至第8个CFU的剂量，并且比野生型菌株高1000倍。注射后，脑组织中的野生细菌在感染后约24小时内迅速增加，达到峰值。在感染突变菌株的小鼠的大脑中，可行的计数会随着时间的推移逐渐下降。
此外，33.3%的突变感染小鼠显示细菌清除从感染点，不像野生型感染动物。感染48小时后，在脾脏和肝脏中完全清除了csA缺陷突变体，而感染野生型菌株的动物则表现出持续感染。所述实验方法通过病理评估（如免疫组织化学、免疫荧光和脑出血分析）可用于分析与这种致命疾病相关的脑损伤。
