成年斑马鱼端脑中疟原虫DNA在活体传递的电穿孔方法

该协议允许在斑马鱼电头对单个环状细胞进行标记，以便进行长期监测，以及以细胞自主的方式操作特定通路。该技术的主要优点是，它允许以快速、高效的方式进行单细胞标记，以及以细胞自主方式进行基因编辑和信号通路操作。该方法允许研究基本的细胞生物学问题，例如，关于细胞分层，上皮平衡的维持，和细胞分裂对称性。

首先使用拔针器具来准备玻璃毛细管。使用微加载器尖端，用十微升质粒溶液填充准备好的玻璃毛细管。然后按菜单改变注射装置上的毛细管"，让针头加载到针架上。

然后将注射装置从更换毛细管切换到注射模式。然后，使用放大倍率为四倍的立体显微镜和 Finden 钳子，只切割毛细管的尖端。然后对脚踏板施加压力，确认质粒溶液很容易从针头中跑出来，不受阻碍。

当针头准备好时，将斑马鱼从饲养罐转移到麻醉液容器中。等几分钟，直到刺的运动消退。将静静鱼背侧压在立体显微镜下的预湿海绵上，使用具有 40 毫米切削刃和 0.5 毫米厚度的不锈钢解剖小刀，在遥脑后侧的鱼头骨上小心地创建一个小孔，就在配镜边界旁边。

必要时倾斜鱼，将玻璃毛细管的尖端以正确的角度向头骨倾斜，以方便毛细管尖端穿过孔。然后，非常小心地将毛细管的尖端插入孔中，通过背膜状细胞层，直到它到达心灵心室，并施加压力到脚踏板约10秒，以提供约1微升的质粒溶液。通过观察绿色液体在整个心室的扩散，可以确认分娩的成功。

用少量的超声波凝胶覆盖鱼电脑。对于质粒注射动物的电穿孔，从注射装置上取出海绵，将电尖的内侧浸入超声波凝胶中。将鱼头放在电极之间，正极在鱼头的腹侧，负极放在后侧。

然后，在海绵中仍然将鱼体固定，轻轻精确地按压电脑，然后用脚踏板管理电流，将电极固定到位，直到所有五个脉冲都完成。如果电穿孔成功，可以在非质粒标记的电镀细胞中观察到标有单质肌细胞的质粒标记。根据电穿孔过程的效率，可以标记更高或更低的倍数电镀细胞。

然而，所演示的协议产生的标签单元格数量比之前发布的协议多。请注意，标记细胞的最高密度往往主要出现在两个半球的内心室侧，因为注射的质粒液体在半球之间分布的方式。在这段视频中，斑马鱼的一个半球以3D显示，其中具有无线电过程的斑马细胞在从侧面观察到时具有品红色。

通过与另一个质粒（标记核）进行共电，可以观察到细胞分裂。不成功的电穿孔导致非常低的数量或没有标记的环质细胞。然而，多生细胞最有可能被标记。

它们的母体在长方体中更大，并且它们不具有从 ependymoglial 细胞层的侧视图看的无线电拉长过程。tdTomato-mem标记的细胞很可能是 ependym 细胞，它们位于 ependymoglia 层之上。相比之下，在单个细胞中引入表示质粒的 tdTomato-mem，除了初始细胞标记外，还会导致 tdTomato-mem 表达。

要记住的最重要的事情是只切毛细管的尖端，并在注射时穿透腹皮层，使液体在整个心室扩散。该技术通过体内成像技术可以长期监测单个细胞，从而确立其在大脑再生中的作用及其庞大的体内遗传联系。