Este protocolo permite a rotulagem de células ependymoglial individuais no telencephalon de zebrafish para permitir seu monitoramento a longo prazo, bem como a manipulação de caminhos específicos de forma autônoma celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a rotulagem de células únicas de forma rápida e eficiente, bem como a edição de genes e a manipulação da via de sinalização de forma autônoma celular. Este método permite a investigação de questões básicas de biologia celular, por exemplo, sobre delaminação celular, manutenção da homeostase epitelial e a simetria da divisão celular.
Comece usando um aparelho de puxar agulhas para preparar capilares de vidro. Use dicas de microcarregador para encher um capilar de vidro preparado com dez microliters de solução plasmida. Em seguida, pressione a mudança capilar do menu" no dispositivo de injeção para permitir que a agulha seja carregada no suporte da agulha.
Em seguida, troque o dispositivo de injeção de mudar o modo capilar para injetar. Em seguida, usando um estereótipo com uma ampliação de quatro vezes, e fórceps Finden, corte apenas a ponta do capilar. Em seguida, aplique pressão no pedal do pé para confirmar que as soluções plasmidas correm facilmente para fora da agulha sem obstáculos.
Quando a agulha estiver pronta, transfira um zebrafish do tanque de criação para um recipiente de solução anestésica. E espere alguns minutos até que o movimento das brânquias diminua. Pressione o lado dorsal do peixe sedado sobre uma esponja pré-molhada sob o estereóscópio, e use um microknife dissecando aço inoxidável com uma borda de corte de 40 milímetros e uma espessura de 0,5 milímetros para criar cuidadosamente um pequeno buraco no crânio do peixe no lado posterior do telencephalon, logo ao lado da borda do tectum óptico.
Incline o peixe conforme necessário e oriente a ponta do capilar de vidro em direção ao crânio no ângulo correto para facilitar a penetração da ponta capilar através do orifício. Em seguida, insira cuidadosamente a ponta do capilar no orifício através da camada celular ependímal dorsal, até chegar ao ventrículo telenceálico, e aplique pressão no pedal do pé por cerca de 10 segundos para entregar aproximadamente 1 microliter da solução plasmida. O sucesso da entrega pode ser confirmado observando a propagação do líquido verde por todo o ventrículo.
Cubra o telencephalon de peixe com uma pequena quantidade de gel de ultrassom. Para eletroporação do animal injetado plasmídeo, remova a esponja da configuração da injeção e mergulhe o lado interno das eletrofinas em gel de ultrassom. Posicione a cabeça do peixe entre os eletrodos, com o eletrodo positivo no lado ventral da cabeça e o eletrodo negativo no lado dorsal.
Em seguida, enquanto ainda segura o corpo do peixe na esponja, pressione os eletrodos suavemente e precisamente contra o telencephalon e administre a corrente com o pedal do pé, segurando os eletrodos no lugar até que todos os cinco pulsos estejam terminados. Se a eletroporação for bem sucedida, plasmid rotulado células ependymoglial simples podem ser observados entre as células ependymoglial não plasmidas. Dependendo da eficiência do processo de eletroporação, pode-se rotular um número maior ou menor de células ependymoglial.
No entanto, o protocolo demonstrado produz um número maior de células rotuladas do que os protocolos publicados anteriormente. Note que a maior densidade de células rotuladas tende a emergir principalmente no lado ventricular interno de ambos os hemisférios devido à forma como o líquido plasmídeo injetado se distribui entre os hemisférios. Neste vídeo, um hemisfério do telencephalon de zebrafish é apresentado em 3D, onde as células ependymoglial com radioprocessos, estão em magenta quando observadas do lado.
Através da co-eletroporação com outro plasmídeo que rotula núcleos, pode-se observar a divisão celular das células ependymoglial. A eletroporação mal sucedida resulta em um número muito baixo ou sem células ependymoglial rotuladas. As células ependísicas dorsais, no entanto, são as mais propensas a serem rotuladas.
Sua soma é maior em cuboide e eles não possuem processos radio alongados tão evidentes a partir de uma visão lateral da camada celular ependymoglial. as células rotuladas tdTomato-mem são provavelmente células ependímicas, que estão localizadas acima da camada de ependymoglia. Em contraste, a introdução de um tdTomato-mem expressando plasmídeos para células ependmyoglial individuais resulta na expressão tdTomato-mem, além da rotulagem celular inicial.
As coisas mais importantes a se lembrar são cortar apenas a ponta do capilar e penetrar na camada ependímal enquanto injeta para que o líquido se espalhe por todo o ventrículo. Essa técnica permite o monitoramento a longo prazo de células ependymoglial únicas através de imagens in vivo e, portanto, estabelecendo seu papel na regeneração cerebral, bem como seu vasto elo genético in vivo.
