Bu protokol, zebra balığı telencephalon bireysel ependymoglial hücrelerin etiketleme onların uzun vadeli izleme sağlamak için izin verir, hem de bir hücre özerk bir şekilde belirli yolların manipülasyon. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek hücreli etiketlemenin hızlı ve verimli bir şekilde etiketlemesine ve hücre özerk bir şekilde gen düzenleme ve sinyal yolu manipülasyonuna olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, örneğin hücre delaminasyonu, epitel homeostazın bakımı ve hücre bölünmesinin simetrisi hakkında temel hücre biyolojisi sorularının araştırılmasını sağlar.
Cam kılcal damarlar hazırlamak için bir iğne çekme cihazı kullanarak başlayın. Plazmid çözeltisi on mikrolitre ile hazırlanmış cam kılcal doldurmak için microloader ipuçları nı kullanın. Daha sonra iğnenin iğne tutucuya yüklenmesini sağlamak için enjeksiyon cihazındaki kılcal damarı değiştir"e basın.
Ardından enjeksiyon cihazını kılcal damarı değiştirip enjekte etme moduna geçin. Daha sonra, dört kat büyütme ile bir stereomikroskop kullanarak, ve Finden forceps, kılcal sadece ucu kesti. Daha sonra plazmid çözeltilerinin iğneden sorunsuz bir şekilde çıktığını doğrulamak için ayak pedalına basınç uygulayın.
İğne hazır olduğunda, bir zebra balığını hayvancılık tankından anestezik çözelti bir kapkabına aktarın. Solungaçların hareketi dinilene kadar birkaç dakika bekleyin. İzole edilmiş balık dorsal tarafını stereomikroskop altında önceden ıslak bir süngerin üzerine bastırın ve optik tektumun hemen yanındaki telencephalon'un arka tarafındaki balık kafatasında küçük bir delik oluşturmak için 40 milimetrelik kesme kenarı ve 0,5 milimetre kalınlığında paslanmaz çelik bir kesme mikrobıçağı kullanın.
Balığı gerektiği gibi yatırın ve cam kılcal damarUcunu doğru açıyla kafatasına doğru yönlendirerek kılcal ucun delikten nüfuz etmesini kolaylaştırın. Daha sonra, çok dikkatli bir şekilde dorsal ependymal hücre tabakası ile deliğe kılcal damar ucu nu takın, telensefalik ventrikül ulaşana kadar, ve yaklaşık 10 saniye boyunca ayak pedalına basınç uygulayın plazmid çözeltisinin yaklaşık 1 mikrolitre teslim etmek için. Teslimat başarısı ventrikül boyunca yeşil sıvı nın yayılmasını gözlemleyerek teyit edilebilir.
Ultrason jel küçük bir miktar ile balık telencephalon kapağı. Plazmid enjekte hayvan Elektroporasyon için, enjeksiyon kurulum dan sünger çıkarın ve ultrason jel içine elektrouçlarıiç tarafı batırın. Balığın kafasını elektrotlar arasına yerleştirin, başın ventral tarafındaki pozitif elektrot ve dorsal taraftaki negatif elektrot.
Daha sonra, hala sünger balık vücudunu tutarken, telencephalon karşı hafifçe ve hassas elektrotlar basın ve ayak pedalı ile akım yönetmek, beş darbeler bitene kadar elektrotlar yerinde tutarak. Elektroporasyon başarılı olursa plazmid etiketli tek ependymoglial hücreler plazmid olmayan ependymoglial hücreler arasında görülebilir. Elektroporasyon sürecinin etkinliğine bağlı olarak, ependymoglial hücrelerin daha yüksek veya daha düşük sayıda etiketlenebilir.
Bununla birlikte, gösterilen protokol, daha önce yayımlanmış protokollere göre daha fazla sayıda etiketli hücre verir. Etiketli hücrelerin en yüksek yoğunluğu enjekte plazmid sıvı hemisferler arasında dağıtır şekilde nedeniyle her iki yarımkürenin iç ventriküler tarafında çoğunlukla ortaya eğilimindedir unutmayın. Bu videoda, zebrabalığı telensefalon bir yarımkürede 3D olarak sunulmaktadır, radyo süreçleri ile ependymoglial hücreleri, yandan gözlendiğinde macenta bulunmaktadır.
Çekirdekleri etiketleyen başka bir plazmid ile birlikte elektroporasyon sayesinde ependymoglial hücrelerin hücre bölünmesi görülebilir. Başarısız elektroporasyon çok düşük sayıda veya hiç etiketli ependymoglial hücreleri ile sonuçlanır. Dorsal ependymal hücreler, ancak, en etiketli olması muhtemeldir.
Onların soma kübik daha büyük ve ependymoglial hücre tabakasının bir yan görünümünden belirgin olarak radyo uzatılmış süreçler sahip değildir. tdTomato-mem etiketli hücreler büyük olasılıkla ependymoglia tabakasının üzerinde bulunan ependymal hücrelerdir. Buna karşılık, bireysel ependmyoglial hücrelere plazmid ifade eden bir tdTomato-mem'in tanıtılması, ilk hücre etiketlemesine ek olarak tdTomato-mem ekspresyonuna neden olur.
Hatırlanması gereken en önemli şey, kılcal damarın sadece ucunu kesmek ve ependymal tabakayı delmek ve böylece sıvı nın ventrikül boyunca yayılmasıdır. Bu teknik, in vivo görüntüleme yoluyla tek ependymoglial hücrelerin uzun süreli izlenmesini sağlar, ve bu nedenle beyin rejenerasyonu rollerini yanı sıra onların geniş in vivo genetik bağlantı kurulması.
