Este protocolo permite el etiquetado de células ependigliales individuales en el telencefallo del pez cebra para permitir su seguimiento a largo plazo, así como la manipulación de vías específicas de manera autónoma de las células. La principal ventaja de esta técnica es que permite el etiquetado de una sola célula de manera rápida y eficiente, así como la edición de genes y la manipulación de la vía de señalización de forma autónoma de las células. Este método permite la investigación de preguntas básicas de biología celular, por ejemplo, sobre la delaminación celular, el mantenimiento de la homeostasis epitelial y la simetría de la división celular.
Comience por usar un aparato de tracción de agujas para preparar capilares de vidrio. Utilice puntas de microcargador para llenar un capilar de vidrio preparado con diez microlitros de solución de plásmido. A continuación, pulse el menú cambiar capilar"en el dispositivo de inyección para permitir que la aguja se cargue en el soporte de la aguja.
A continuación, cambie el dispositivo de inyección de cambiar el capilar al modo de inyección. Luego, usando un estereomicroscopio con un aumento cuatro veces, y fórceps Finden, corta solo la punta del capilar. A continuación, aplique presión sobre el pedal para confirmar que las soluciones de plásmido salen fácilmente de la aguja sin obstáculos.
Cuando la aguja esté lista, transfiera un pez cebra del tanque de cría a un recipiente de solución anestésica. Y espera unos minutos hasta que el movimiento de las branquias desaparezca. Presione el lado dorsal del pez sedado hacia arriba sobre una esponja pre-humedecida debajo del estereomicroscopio, y utilice una microknife diseccionante de acero inoxidable con un filo de corte de 40 milímetros y un grosor de 0,5 milímetros para crear cuidadosamente un pequeño agujero en el cráneo del pez en el lado posterior del telencéfalo, justo al lado del borde del tectum óptico.
Incline el pez según sea necesario y oriente la punta del capilar de vidrio hacia el cráneo en el ángulo correcto para facilitar la penetración de la punta capilar a través del agujero. A continuación, inserte muy cuidadosamente la punta del capilar en el orificio a través de la capa celular ependimal dorsal, hasta que llegue al ventrículo telencéfalo, y aplique presión al pedal durante unos 10 segundos para entregar aproximadamente 1 microlitro de la solución de plásmido. El éxito de la entrega se puede confirmar observando la propagación del líquido verde a lo largo del ventrículo.
Cubra el telencéfalo de pescado con una pequeña cantidad de gel de ultrasonido. Para la electroporación del animal inyectado plásmido, retire la esponja de la configuración de la inyección y sumerja el lado interno de las puntas electromagnida en gel de ultrasonido. Coloque la cabeza del pez entre los electrodos, con el electrodo positivo en el lado ventral de la cabeza y el electrodo negativo en el lado dorsal.
Luego, mientras mantiene el cuerpo del pez en la esponja, presione los electrodos suavemente y con precisión contra el telencéfalo y administre la corriente con el pedal, sosteniendo los electrodos en su lugar hasta que los cinco pulsos estén terminados. Si la electroporación es exitosa, se puede observar un plásmido etiquetado con células ependipogliales individuales entre las células ependigliales no plásmidas etiquetadas. Dependiendo de la eficiencia del proceso de electroporación, se puede etiquetar un número mayor o menor de células ependipogliales.
Sin embargo, el protocolo demostrado produce un mayor número de celdas etiquetadas que los protocolos publicados anteriormente. Tenga en cuenta que la mayor densidad de células etiquetadas tiende a emerger principalmente en el lado ventricular interno de ambos hemisferios debido a la forma en que el líquido plásmido inyectado distribuye entre los hemisferios. En este video, un hemisferio del tetófalo del pez cebra se presenta en 3D, donde las células ependimogliales con procesos radioeléctricos, se encuentran en magenta cuando se observan desde el lado.
A través de la co-electroporación con otro plásmido que etiqueta los núcleos, se puede observar la división celular de las células ependimogliales. La electroporación sin éxito da como resultado un número muy bajo o ninguna célula ependiglial etiquetada. Las células ependimales dorsales, sin embargo, son las más propensas a ser etiquetadas.
Su soma es más grande en cuboide y no poseen procesos radio-alargados como se evidencia desde una vista lateral de la capa celular ependimoglial. Las células etiquetadas tdTomato-mem son probablemente células ependimales, que se encuentran por encima de la capa de ependymoglia. Por el contrario, la introducción de un plásmido-mem que expresa plásmido a células ependmyoglial individuales da como resultado la expresión tdTomato-mem además del etiquetado celular inicial.
Lo más importante a recordar es cortar sólo la punta del capilar y penetrar la capa ependimal durante la inyección para que el líquido se propague por todo el ventrículo. Esta técnica permite el monitoreo a largo plazo de células ependimogliales individuales a través de imágenes in vivo, y por lo tanto establecer su papel en la regeneración cerebral, así como su vasto vínculo genético in vivo.
