在暴露于臭氧的小鼠的弹性周期中的肺微 rna 分析

这种方法可以帮助回答肺免疫领域关于如何评估微RNA的表达，预测调节肺部炎症基因的关键问题。该技术为确定循环激素对肺微RNA表达的贡献提供了简单的方法。要评估雌性周期阶段，手动约束一只八到九周大的雌性小鼠，并引入充满超纯水的塑料 10 微升移液器的尖端。

轻轻冲洗四到五次以收集样品，并将阴道液的最终冲洗沉积到玻璃滑梯上。然后在光学显微镜下以 20 倍的放大率观察未污染的阴道冲洗。对于臭氧和过滤空气暴露，将最多四只小鼠放入两个单独的 1.2 升玻璃容器中，其中带网状盖。

将一个玻璃容器放入臭氧室，将一个放在过滤的空气暴露室中。然后将臭氧浓度调整为百万分之二，三小时后取出容器。暴露4小时后，用70%乙醇对第一只实验鼠的暴露皮肤表面进行消毒，并切开肋骨笼，露出心脏和肺部。

使用钳子将 1.5 毫升无 RNase 微离心管淹没在液氮中，并在液氮中捕捉冷冻收获的肺。然后使用不锈钢组织粉碎机对整个肺进行毛化，并在两个1.5毫升的微离心管之间分离粉碎的组织。以同样的方式从所有动物身上采集和粉碎肺部后，在每个样品中加入500微升硫化硫化物，并连续用18、21和23个量表针使每个组织均匀化。

上次均质化后，在每个样品中加入500微升乙醇，然后涡旋15秒。将混合物加载到单个收集管中的单个旋转柱中，用于离心并丢弃流水线。对于DNase 1治疗，在每列中加入400微升RNA洗涤缓冲液，用于另一个离心，并在无RNase管中混合5微升DNase 1和75微升DNA消化缓冲液。

将混合物直接加入柱基，在室温下孵育15分钟，然后通过离心洗涤两个400微升RNA预洗溶液。为了对RNA进行测，将35微升无DNase无水直接添加到每个柱基中，进行最终离心，并在分光光度计上测量每个样品的总RNA浓度和纯度。然后将RNA储存在零下80摄氏度。

对于小RNase的逆转，将200纳米的总RNA添加到10微升预洗溶液中，加入每个样品的一管逆转录反应混合物。混合后，将样品短暂离心，放在冰上，直到孵育。接下来，在37摄氏度下孵育管子60分钟，随后在95摄氏度下孵育5分钟。

在第二次孵育结束时，每20微升逆转录反应用200微升无RNase水稀释CDNA，并在预加载小鼠炎症反应和自身免疫性微RNA PCR阵列的每个井中加入10微升每个反应混合样品。通过圆形和形状良好的核上皮细胞的存在，可以识别前体阶段。当小鼠处于雌激素阶段时，在涂片中观察到密集的聚集被感染、玉米化和鳞状上皮细胞。

在三聚体中，可以看到玉米化上皮细胞和多态核白细胞。在死细胞中，白细胞通常更为普遍。如证明，从四个小鼠肺中提取的RNA每微升1198至2178南克，平均 A260 至 A280 比 2.01 和 2.02 之间，平均 A260 至 A230 比 2.139 和 2.223 之间。

在此表中，显示了臭氧和被过滤空气暴露的小鼠之间微RNA表达的两倍变化。在微RNA靶点滤波器和14个微RNA核心分析后，获得显著的表达对数比和P值，这些数据可以通过微RNA靶点滤波器进行映射。核心分析还提供有关规范途径、疾病和功能、调节器和网络的信息。

此外，功能分析软件可用于生成网络分析，显示感兴趣的微RNA与其他分子之间的关系。在尝试此过程时，在进行实验之前，每天至少连续检查三个周期的酯循环非常重要。按照这个程序，可以执行其他方法来回答有关肺炎基因表达在整个雌激素周期的其他问题。

开发后，该技术为肺免疫领域的其他研究人员利用其他模型探索性激素调节机制铺平了道路。