伪多多尼亚是一种BSL-2级病原体。在处理此生物体时，请记住遵循所有 BSL-2 级别安全实践。在这里，我们将演示原发细胞分离、体外噬菌体病和噬菌体通路分析，以及小鼠体内噬菌体和细菌清除评估。
成功的腹内输送需要实践来掌握。确保微音器正确加载，针头位于两个声褶之间，柱塞速度得到适当控制。首先将鼠标固定在超活位置，四肢铺在用纸巾覆盖的解剖板上，并在门牙下钩上一根绳子来缩回头部，使气管定位直，水平。
用70%乙醇对鼠标进行消毒，并使用常规钳子拉起身体中心线的皮肤。使用手术剪刀将皮肤从腹部切到喉咙顶部。使用标准手术剪刀的钝端仔细解剖喉部肌肉和结缔组织。
打开肋骨下方的腹壁。切开隔膜，切掉肋骨的下部，部分暴露肺部。使用弹簧剪刀露出气管，并使用钳子抓住软骨环。
使用微型剪刀小心地在气管的腹孔面上切开大约 1.5 毫米的切口。小心地将短长度的缝合线串在气管下面，并将一个 18 表管插入气管。当管管就位时，每次洗涤用一毫升新鲜 PBS 轻轻洗刷肺部三次，轻轻地将液体提取到注射器中，然后连续三次重新注入肺部。
每次熔岩后，将收集的支气管熔岩液或BALF转移到15毫升锥形管中，以离心总收获的流体。将颗粒重新放入一毫升新鲜PBS中进行第二次离心，然后将洗涤的道利巨噬细胞重新泵入Dulbeco的改性鹰中或DMEM的两毫升中，辅以10%的非热灭活胎儿牛血清。然后将原发性道外巨噬细胞转移到玻璃底培养皿中，在37摄氏度的细胞培养箱中进行为期两天的培养。
48小时后，用一毫升PBS清洗培养，然后用两毫升新鲜介质喂养培养。接下来，将每个细胞的50个直径为2微米直径的箱式乳胶进发乳胶、结合珠子加入培养，在细胞培养箱中以37摄氏度的温度下孵育一小时。在孵育结束时，每次洗涤用一毫升新鲜PBS广泛清洗板五次，取出细胞外珠，并随机成像100个细胞，以计算含有细胞内珠的细胞。
对于结果化测定，在室温下用50微升的兔子抗SRBC免疫球蛋白M或IgM孵育2倍10至第八羊红血球或SRBCs，在室温下孵育30分钟。然后在37摄氏度下用50微升C5缺乏的人类血清孵育蛋白化SRBCs，在37摄氏度下孵育30分钟，以修复IgM涂层SRBCs上的C3b和C3b抑制剂补充片段。接下来，吸气介质，将 100 微升（1 倍 10）添加到每毫升介质的 7 个反化 SRBC 中，每 96 井板包含 1 倍 10 至第四个通宵培养的 murine 巨噬细胞。
在37摄氏度下孵育SRB小鼠巨噬细胞共培养一小时，然后用100微升氯化铵解钾解液缓冲液清洗，取出未绑定的SRBCs。移除未绑定的 SRBC 后，使用 100 微升介质冲洗。用0.1%的硫酸钠将剩余的细胞酶化，用50微升的2、7-二甲基黄丙烯，辅以3%过氧化氢和6个摩尔尿素来治疗赖酸盐。
然后在620纳米的分光光度计上测量血红蛋白催化氟烯蓝色地层吸收度。使用具有已知 SRBC 数量的 620 纳米吸收度值的标准曲线来确定邻苯二甲酸化 SRBC 的数量。为了评估模式识别受体中位噬菌体，用1毫升PBS清洗两天培养小鼠原肺泡巨噬细胞，用含有100个Alexa氟-488结合的Zymosan-A-生物粒子的500微升新鲜介质治疗细胞。
在37摄氏度下一小时后，用500微升的冰冷PBS来阻止吞噬，每次洗涤一毫升PBS，对细胞进行五次大面积清洗。上次洗涤后，在室温下用4%甲醛固定细胞10分钟，然后像证明的另外5次清洗细胞。上次洗涤后，用500微升新鲜PBS覆盖细胞，在差分干扰对比度和荧光通道下以488纳米进行成像，以量化含有齐莫桑-A-生物粒子的道白道巨噬细胞的数量。
对于体内肺囊巨噬细胞位评估，确认适当的水平的电合，在麻醉小鼠的手指捏没有反应，并放置鼠标在平板与塑料线下上切口。将鼠标放在半卧式讲台上，位置为 45 度，心室朝上，使用弯曲钳子拉出并抑制舌头。然后插入一个微普拉耶之间的声乐褶皱，以内管内管理50微升五倍10到6个殖民地形成单位的P.aeruginosa GFP到麻醉动物的肺部。
要确认微普拉耶针在气管中，请轻轻移动注射器并观察针头两侧的声褶。感染一小时后，收集熔岩液，正如刚刚证明的，通过离心分解对起源的巨噬细胞进行颗粒化。将10倍的三分之一的新鲜PBS重新淹没在玻璃幻灯片上，用于细胞离心。
然后根据标准组织化学方案，对道拉巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞进行分色染色。随机选择100个道道巨噬细胞，以量化噬菌体的细胞百分比。在第一次体内细菌清除试验中，在两节内将每毫升P.aeruginosa第五菌群形成单位约2.5至5倍的亚莱特剂量注射到麻醉野生型和突变小鼠中，并在六天内每天测量每只动物的体重。
在第二次试验中，将一组新的野生型小鼠和突变小鼠注射至每毫升剂量的7个菌落形成单位，并在注射后两天内记录死亡率，在注射死亡时或注射后两天内收集整个肺组织，以在高峰感染时量化肺细菌负担。收获肺部后，将肺样本切成小块，使用调整后的电动均质器设置使肺碎片均质。然后板100微升的均质到伪多莫纳斯隔离加糖板在10倍的连续稀释。
荧光显微镜显示，小鼠初级肺功能巨噬细胞噬菌体感染的 FITC 乳胶珠发生在一个小时的孵育后，与 TRIM72 敲除巨噬细胞显示明显更高的噬菌体能力。相反，TRIM72（一种在巨噬细胞中功能不明的蛋白质）的过度表达，导致补充吞噬症减少五倍以上。然而，亚历克萨氟-488结合的Zymosan-A粒子被从野生型或敲除小鼠中分离出的主要道长巨噬细胞以相等数量摄入。
从野生类型和淘汰动物收获的BALF的差别染色揭示了类似数量的巨噬细胞，但从敲除小鼠中收获的巨噬细胞的噬菌体能力更高。此外，TRIM72淘汰小鼠表现出更快的恢复其体重，保持其生存，并表现出比野生类型动物在内切内P.aeruginosa管理后较低的细菌负担。利用这项技术，可以分析其他对肺炎重要的噬菌体过程，如嗜中性粒细胞病和其他噬细胞在细菌清除中的相对贡献。
结合药理抑制剂、适应性转移和转基因动物，该技术可以帮助研究人员探索特定类型的噬菌体分子成分。
