生成心室样HiPSC衍生的心肌细胞和用于钙处理特征的高质量细胞制剂

在诱导干细胞衍生的心肌细胞时，可重复性是主要问题。使用这些方法，高纯度和高质量的心肌细胞可以从 iPS 中产生，用于功能研究。该技术的主要优点是，这是一种简单、可靠、经济高效、极其强大的方法，用于获得 iPSC 衍生心肌细胞的纯化、高质量制剂。

对于细胞传传，用一毫升PBS冲洗细胞，不带钙和镁7至10分钟，然后用一毫升的传传介质替换PBS。使用细胞提升器，轻轻地从井底刮取细胞，并使用无菌的两毫升玻璃移液器机械地分离分离的细胞。当细胞被提升到显微镜下可见的小簇时，添加传通介质以一比六的比例分裂细胞。

接下来，从六井板中吸出人类胚胎干细胞合格基质。然后将一毫升的传中和一毫升分离的细胞添加到每个井中，让细胞生长，直到它们达到70至80%的汇合，然后开始心脏分化。在分离 iPSC-CMs 之前至少 30 分钟，用 70% 乙醇擦拭单个玻璃盖滑，然后将盖滑入无菌六孔板的单个孔中。

当盖板干燥后，将250至300微升的人类胚胎干细胞合格基质溶液直接添加到每个盖滑的中心，并将六个井板放在组织培养罩中。分离代谢选择的 iPSC-CM 添加一毫升无菌 0.25% trypsin 与 EDTA 到每个井在 35 摄氏度下孵育 5 分钟，并使用 1000 微升移液器机械分离细胞，直到实现单个细胞悬浮。将细胞在无菌的15毫升锥形管中拉，用每孔两毫升的RPMI 20介质清洗每孔。

然后将洗涤液加入管子中，通过离心使细胞产生颗粒。以足够量的介质重新增加细胞，达到每250微升细胞浓度的3倍10至第五细胞。使用 1000 毫升移液器尖端分离细胞，直到溶液看起来是同质的。

然后将250微升细胞吸进1000微升移液器尖端，并缓慢地将整体积溶液分配到一个人类胚胎干细胞合格基质编码盖滑上。当所有细胞都播种后，小心地将盘子放入细胞培养箱中过夜。第二天早上，轻轻将两毫升的D7介质加入到每井中。

当选定的 iPSC-CM 达到至少三个月大时，用两个微升 Fura-2 AM 治疗细胞，在 37 摄氏度下 10 分钟，并打开钙分析系统电源。启动 ArcLamp，将泵中的管连接到相应的入口和出水口，将电子导线从刺激器连接到腔室。将腔室放在系统上。

用 37 摄氏度加热 Tyrode 溶液填充流经流体内线加热器的 ProFusion 管，并调整相机和帧光圈尺寸，以最大限度地减少背景区域。将用 iPSC-CMs 种子的玻璃盖将滑入腔室，并轻轻地将 500 微升的 Tyrode 溶液直接添加到盖滑上。以每分钟 1.5 毫升的速率开始使用 Tyrode 的溶液，并使用电动刺激器以 1 赫兹场刺激的速度对 iPC-CMs 进行速度调整，每 4 毫秒 10 伏特，间隔 3 到 5 分钟。

当所有染料都冲出腔室后，将观察窗口调整到盖滑的左上角区域，然后开始录制。收集 5 到 10 个峰值的一致流后，单击暂停以暂时停止录制，并在恢复录制之前将显微镜舞台移动到盖滑的对立面的相邻区域。在扫描整个盖片中的钙转性后，在 10 分钟内以相同的方式扫描数据，根据制造商的说明使用适当的荧光微量分析软件进行分析数据。

该协议产生高度纯的心肌细胞，随着时间的推移，在培养中获得心室、成人样表型。根据心房和心室MLC2等构体免疫荧光染色评估，该协议产生的大多数细胞在心脏分化诱导后的第30天是心房MLC2异构体阳性。而心室MLC2等分形式在同一时间点以大量数字表示。

随着培养时间的增加，观察到完全切换到 MLC2 等构形式。这些数据还通过流式细胞测量对心房和心室MLC2标记表达细胞的百分比进行定量确认。在第90天，iPSC-CMs中的钙振幅显著增加，与成年大鼠CMs的钙振幅相似。

需要注意的是，污染非心脏细胞可能会影响人体 iPSC-CMs 在分化过程中的功能成熟。此外，在 iPSC-CMs 中记录钙瞬变时，有必要让细胞在恒定刺激下稳定在 37 摄氏度，持续至少 200 秒，并限制记录到特定时间窗口，以确保可重复的结果。请记住，iPSC 表现出均匀形态，并允许细胞在启动心脏分化之前增长到 70 至 80% 的汇合。

未成熟的 iPS 衍生心肌细胞的纯质量可能显示改变的功能特征，这些特性不反映真正的表型，但可能被误解为患病的表型。因此，获得纯净和高质量的心肌细胞对于提供一致和可重复的结果非常重要。