A reprodutibilidade é uma grande preocupação ao induzir cardiomiócitos derivados de células-tronco. Utilizando esses métodos, cardiomiócitos de alta pureza e alta qualidade podem ser gerados a partir de iPS para seu uso em estudos funcionais. A principal vantagem desta técnica é que é um método simples, confiável, econômico e extremamente poderoso para obter preparações purificadas e de alta qualidade de cardiomiócitos derivados do iPSC.
Para a passagem celular, enxágue as células com um mililitro de PBS sem cálcio e magnésio por sete a 10 minutos antes de substituir o PBS por um mililitro de meio de passagem. Usando um levantador de células, raspe suavemente as células do fundo dos poços, e use uma pipeta de vidro de dois mililitros para dissociar mecanicamente as células separadas. Quando as células tiverem se levantado em pequenos aglomerados como visíveis sob o microscópio adicione meio de passagem para dividir as células em uma proporção de um a seis.
Em seguida, aspire a matriz qualificada de células-tronco embrionárias humanas da placa de seis poços. Em seguida, adicione um mililitro de média de passagem e um mililitro de células dissociadas a cada poço, e deixe as células crescerem até atingirem 70 a 80% de confluência antes de iniciar uma diferenciação cardíaca. Pelo menos 30 minutos antes de dissociar os iPSC-CMs, limpe os deslizamentos individuais de tampa de vidro com 70% de etanol e coloque a tampa em poços individuais de uma placa de seis poços estéril.
Quando os deslizamentos de cobertura secarem, adicione uma solução de matriz qualificada de células-tronco embrionárias humanas diretamente no centro de cada deslizamento de cobertura, e coloque a placa de seis poços na capa da cultura tecidual. Para dissociar o iPSC-CM metabolicamente selecionado adicione um mililitro de trippsina estéril de 0,25% com EDTA a cada poço para uma incubação de cinco minutos a 35 graus celsius, e use uma pipeta de 1000 microliter para dissociar mecanicamente as células até que uma única suspensão celular seja alcançada. Puxe as células em tubo cônico estéril de 15 mililitros e lave cada poço com dois mililitros de RPMI 20 médio por poço.
Em seguida, adicione as lavagens ao tubo e pelota as células por centrifugação. Resuspend as células em um volume suficiente de meio para alcançar um três vezes 10 para as quintas células por 250 microliters de concentração celular. Use uma ponta de pipeta de 1000 mililitros para dissociar as células até que a solução pareça ser homogênea.
Em seguida, aspire 250 microliters de células em uma ponta de pipeta de 1000 microliter, e lentamente distribua todo o volume de solução em um deslizamento de capa codificada de células-tronco embrionárias humanas. Quando todas as células tiverem sido semeadas, coloque cuidadosamente a placa na incubadora de cultura celular durante a noite. Adicione suavemente dois mililitros de média D7 para cada poço na manhã seguinte.
Quando os iPSC-CMs selecionados atingem pelo menos três meses de idade, tratam as células com dois microliters de Fura-2 AM por 10 minutos a 37 graus Celsius, e energia no sistema de análise de cálcio. Inicie o ArcLamp e conecte os tubos da bomba à entrada e saídas apropriadas e ao fio eletrônico do estimulador para a câmara. Coloque a câmara no sistema.
Encha o tubo ProFusion que atravessa o aquecedor de delineado fluido com 37 graus Celsius aqueceu a solução de Tyrode, e ajuste a câmera e enquadrar as dimensões de abertura para minimizar a área de fundo. Aperte o deslizamento de tampa de vidro semeado com iPSC-CMs na câmara, e adicione suavemente 500 microliters da solução de Tyrode diretamente em cima do deslizamento de tampa. Comece a profusar a câmara com a solução de Tyrode a uma taxa de 1,5 mililitro por minuto, e use um estimulador elétrico para acelerar os iPC-CMs com 1 estimulação de campo Hertz a 10 volts a cada quatro milissegundos por três a cinco minutos.
Quando todo o corante tiver sido lavado para fora da câmara, ajuste a janela de visualização para a região superior esquerda do deslizamento da tampa, e comece a gravação. Depois de coletar um fluxo consistente de cinco a 10 picos clique em pausa para parar temporariamente a gravação e mover o estágio do microscópio para uma área adjacente para a extremidade oposta do deslizamento de cobertura antes de retomar a gravação. Depois de digitalizar a transitoriedade de cálcio em toda a cobertura, deslize da mesma forma durante um período de 10 minutos, analise os dados com um software apropriado de análise de vestígios de floresnce de acordo com as instruções do fabricante.
Este protocolo gera cardiomiócitos altamente puros que adquirem um fenótipo ventricular, semelhante a um adulto na cultura ao longo do tempo. Conforme avaliado pela coloração imuno fluorescente para as isoformas atrial e ventricular MLC2, a maioria das células geradas por este protocolo são atrial MLC2 isoform positivo no dia 30 após a indução da diferenciação cardíaca. Enquanto isoformes ventriculares MLC2 são expressos em muitos números ao mesmo tempo.
À medida que o tempo na cultura aumenta, observa-se uma mudança completa para as isoformas MLC2. Esses dados também foram confirmados pela quantificação citométrica de fluxo da porcentagem de células expressas do marcador MLC2 atrial e ventricular. A amplitude de cálcio é significativamente aumentada nos iPSC-CMs no dia 90, semelhante à observada para CMs de ratos adultos.
É importante notar que contaminar células não cardíacas pode influenciar a maturação funcional dos iPSC-CMs humanos durante a diferenciação. Além disso, quando registram transitórios de cálcio em iPSC-CMs é necessário permitir que as células se estabilizem a 37 graus Celsius sob estimulação constante por pelo menos 200 segundos, e restringir as gravações a uma janela de tempo específica para garantir resultados reprodutíveis. Lembre-se de confirmar que os iPSCs apresentam uma morfologia homogênea e para permitir que as células cresçam de 70 a 80% de confluência antes de iniciar uma diferenciação cardíaca.
A qualidade pura em cardiomiócitos imaturos derivados do iPS pode apresentar características funcionais alteradas, que não refletem o fenótipo real, mas podem ser mal interpretadas como o fenótipo doente. Portanto, a obtenção de cardiomiócitos puros e de alta qualidade é importante para proporcionar resultados consistentes e reprodutíveis.
