Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler indüklenirken tekrarlanabilirlik önemli bir sorundur. Bu yöntemler kullanılarak, fonksiyonel çalışmalarda kullanılmak üzere iPS'den yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli kardiyomiyositler üretilebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin saflaştırılmış, yüksek kaliteli preparatlarını elde etmek için basit, güvenilir, uygun maliyetli ve son derece güçlü bir yöntem olmasıdır.
Hücre geçişi için, bir mililitre lik bir mililitre lik orta ile PBS'yi değiştirmeden önce hücreleri kalsiyum ve magnezyum suz bir mililitre ile 7 ila 10 dakika durulayın. Bir hücre kaldırıcı kullanarak, yavaşça kuyuların altından hücreleri kazıyın ve mekanik müstakil hücreleri ayrıştırmak için steril iki mililitre cam pipet kullanın. Hücreler mikroskop altında görünür olarak küçük kümeler halinde kaldırdı zaman bir ila altı oranında hücreleri bölmek için geçiş ortamı ekleyin.
Sonra, altı kuyu plaka insan embriyonik kök hücre nitelikli matris aspire. Sonra her kuyuya bir mililitre passaging ortamı ve bir mililitre ayrıştırılmış hücre ekleyin ve hücrelerin kardiyak farklılaşmaya başlamadan önce %70 ila %80'lik biraraya gelene kadar büyümesine izin verin. iPSC-CM'leri ayırmadan en az 30 dakika önce, tek tek cam kapak fişlerini %70 etanol ile silin ve kapak fişlerini steril altı kuyu plakasının tek tek kuyularına yerleştirin.
Kapak fişleri kuruduğunda, 250 ila 300 mikrolitre insan embriyonik kök hücre nitelikli matris çözeltisini doğrudan her kapak fişinin ortasına ekleyin ve altı kuyu plakasını doku kültürüne yerleştirin. Metabolik olarak seçilmiş iPSC-CM ayırmak için 35 santigrat derece beş dakikalık kuluçka için her kuyuya EDTA ile steril 0.25% tripsin bir mililitre eklemek ve mekanik tek bir hücre süspansiyon elde edilene kadar hücreleri ayırmak için 1000 mikrolitre pipet kullanın. Steril 15 mililitrekonik tüp hücreleri çekin ve iyi başına RPMI 20 orta iki mililitre ile her iyi yıkayın.
Daha sonra tüpe yıkıntıları ekleyin ve santrifüj ile hücreleri pelet. Hücrelerin konsantrasyonu 250 mikrolitre başına beş hücre üç kez 10 elde etmek için orta yeterli hacimde hücreleri yeniden askıya. Çözelti homojen görünene kadar hücreleri ayrıştırmak için 1000 mililitrelik pipet ucu kullanın.
Daha sonra 1000 mikrolitrelik pipet ucuna 250 mikrolitre hücre aspire edin ve çözeltinin tüm hacmini yavaş yavaş bir insan embriyonik kök hücresi nitelikli matris kodlu kapak fişine dağıtın. Tüm hücreler tohumlanmış zaman, dikkatle hücre kültürü kuluçka içine bir gecede plaka yerleştirin. Yavaşça her iyi ertesi sabah için D7 orta iki mililitre ekleyerek.
Seçilen iPSC-CM'ler en az üç aylık olduğunda hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca iki mikrolitre Fura-2 ile tedavi edin ve kalsiyum analiz sistemindegüç kullanın. ArcLamp başlatın ve uygun giriş ve çıkışları ve odaya uyarıcı gelen elektronik tel pompa tüpleri bağlayın. Odayı sisteme yerleştirin.
37 santigrat derece ile akışkan inlined ısıtıcı ile çalışan ProFusion tüp doldurun Tyrode's çözüm ısıtTı, ve arka plan alanı en aza indirmek için kamera ve çerçeveleme diyafram boyutları ayarlayın. IPSC-CM'lerle tohumlanmış cam kapağı nı odaya sabitle ve Tyrode'un çözeltisinin 500 mikrolitresini doğrudan kapak fişinin üzerine ekleyin. Dakikada 1,5 mililitre hızında Tyrode's çözeltisi ile oda profusing başlayın ve üç ila beş dakika boyunca her dört milisaniyede 10 volt 1 Hertz alan stimülasyon ile iPC-CMs hızı için bir elektrik uyarıcı kullanın.
Boyanın tamamı odadan yıkandığında, görüntüleme penceresini kapak fişinin sol üst bölgesine ayarlayın ve kaydı başlatın. Beş ila 10 tepeden oluşan tutarlı bir akış topladıktan sonra kaydı geçici olarak durdurmak için duraklatma'yı tıklatın ve kaydı devam ettirmeden önce kapağın diğer ucu için mikroskop aşamasını bitişik bir alana taşıyın. 10 dakikalık bir süre boyunca tüm kapak kayma boyunca kalsiyum geçiciliği tarandıktan sonra üreticinin talimatlarına uygun uygun floresan izleme analiz yazılımı ile verileri analiz edin.
Bu protokol, zaman içinde kültürde ventriküler, yetişkin benzeri bir fenotip elde eden son derece saf kardiyomiyositler üretir. Atriyal ve ventrikül MLC2 izoformları için immünüplin floresan boyama ile değerlendirildiği gibi, bu protokol tarafından oluşturulan hücrelerin çoğunluğu kardiyak farklılaşmain indüksiyonundan sonra 30. Ventriküler MLC2 izoformları aynı anda çok sayıda ifade edilir iken.
Kültürde zaman arttıkça MLC2 izoformlarına tam bir geçiş gözlenir. Bu veriler aynı zamanda atriyal ve ventriküler MLC2 belirteç hücrelerinin yüzdesinin akış sitometrik niceliği ile de doğrulandı. Kalsiyum genliği önemli ölçüde iPSC-CMs gün 90, yetişkin sıçan CMs için gözlenen benzer artar.
Kardiyak olmayan hücrelerin kontamine edilmesinin farklılaşma sırasında insan iPSC-CM'lerinin fonksiyonel olgunlaşmasını etkileyebileceğini unutmayın. Ayrıca, iPSC-CM'lerde kalsiyum geçicilerini kaydettirdiğinizde, hücrelerin en az 200 saniye boyunca sabit uyarılma altında 37 derecede stabilize olmasına izin vermek ve kayıtları tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için belirli bir zaman penceresiyle sınırlamak gerekir. IPSC'lerin homojen bir morfoloji sergilediğini ve hücrelerin kardiyak farklılaşmayı başlatmadan önce %70 ila %80'e kadar büyümesine izin vermeyi unutmayın.
Olgunlaşmamış iPS kaynaklı kardiyomiyositlerde saf kalite, gerçek fenotipi yansıtmayan, ancak hastalıklı fenotip olarak yanlış yorumlanabilecek değiştirilmiş fonksiyonel özellikler gösterebilir. Bu nedenle, saf ve yüksek kaliteli kardiyomiyosit elde tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için önemlidir.
