הדור של היפנוציטים באיכות גבוהה והתרופות לאפיון הטיפול בסידן

רבייה היא דאגה העיקרית כאשר גרימת קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע. באמצעות שיטות אלה, טוהר גבוה ו cardiomyocytes באיכות גבוהה יכול להיווצר iPS לשימושם במחקרים פונקציונליים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי היא שיטה פשוטה, אמינה, חסכונית, וחזקה מאוד להשגת מטוהרים, הכנות באיכות גבוהה של קרדיומיוציטים שמקורם iPSC.

עבור מעבר תאים, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS ללא סידן ומגנזיום במשך שבע עד 10 דקות לפני החלפת PBS עם מיליליטר אחד של מדיום עובר. באמצעות מרים תאים, בעדינות לגרד את התאים מתחתית הבארות, ולהשתמש פיפטה זכוכית סטרילי שני מיליליטר כדי לנתק מכנית את התאים מנותקים. כאשר התאים התרוממים לאשכולות קטנים כפי שהם נראים מתחת למיקרוסקופ מוסיפים מדיום עובר כדי לפצל את התאים ביחס של אחד עד שישה.

לאחר מכן, שאף את המטריצה המוסמכת של תאי הגזע העובריים האנושיים מצלחת ששת הבאר. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של עובר בינוני ומיליליטר אחד של תאים מנותקים לכל באר, ולתת לתאים לגדול עד שהם מגיעים 70 עד 80% confluency לפני תחילת התמדה לבבית. לפחות 30 דקות לפני ניתוק iPSC-CMs, לנגב מחליק כיסוי זכוכית בודד עם 70% אתנול, ולמקם את הכיסוי מחליק לתוך בארות בודדות של צלחת סטרילית שש באר.

כאשר החלקות הכיסוי התייבשו, להוסיף 250 עד 300 microliters של תא גזע אנושי מוסמך פתרון מטריצה ישירות למרכז של כל להחליק כיסוי, ולמקם את צלחת שש היטב במכסה המנוע של תרבות הרקמה. כדי לנטרל את iPSC-CM שנבחר באופן מטבולי להוסיף מיליליטר אחד של סטרילי 0.25% טריפסין עם EDTA לכל באר עבור דגירה של חמש דקות ב 35 מעלות צלזיוס, ולהשתמש פיפט 1000 microliter כדי לנטרל מכנית את התאים עד השעיה תא יחיד הושג. משוך את התאים בצינור חרוט סטרילי 15 מיליליטר, ולשטוף כל באר עם שני מיליליטר של RPMI 20 בינוני לגם.

לאחר מכן מוסיפים את הכביסה לצינור וכדור התאים על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר בתאים בנפח מספיק של מדיום כדי להשיג שלוש פעמים 10 לתאים החמישיים לכל 250 מיקרוליטרים של ריכוז תאים. השתמש בקצה פיפט 1000 מיליליטר כדי לנתק את התאים עד שהפתרון נראה הומוגני.

לאחר מכן שאפו 250 מיקרוליטרים של תאים לקצה פיפט של 1000 מיקרוליטר, ופונו באיטיות את כל נפח הפתרון לתגוח כיסוי מקודד אחד של תאי גזע עובריים. כאשר כל התאים כבר זרעו, בזהירות למקם את הצלחת לתוך החממה תרבות התא לילה. בעדינות הוספת שני מיליליטר של D7 בינוני לכל באר למחרת בבוקר.

כאשר iPSC-CMs שנבחרו מגיעים לפחות שלושה חודשים לטפל בתאים עם שני microliters של Fura-2 AM במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, וכוח על מערכת ניתוח סידן. ליזום את ArcLamp ולחבר את הצינורות מהמשאבה לשקעים המתאימים ואת החוט האלקטרוני מן הממריץ לתא. שים את התא על המערכת.

מלאו את צינור ProFusion העובר דרך התנור הנוזלי עם 37 מעלות צלזיוס חיממו את הפתרון של טירודה, והתאימו את מידות המצלמה והצמצם המסגור כדי למזער את אזור הרקע. הדקו את כיסוי הזכוכית עם iPSC-CMs לתוך התא, והוסיפו בעדינות 500 מיקרוליטרים של הפתרון של טירודה ישירות על גבי החלקת הכיסוי. התחילו למזג את התא עם הפתרון של טירוד בקצב של 1.5 מיליליטר לדקה, ולהשתמש בממריץ חשמלי כדי לקצב את ה-iPC-CMs עם גירוי שדה 1 הרץ ב 1 וולט כל ארבע אלפיות שנייה במשך שלוש עד חמש דקות.

כאשר כל הצבע נשטף מהתא, התאם את חלון הצפייה לאזור השמאלי העליון של החלק השמאלי העליון של המכסה, והתחל בהקלטה. לאחר איסוף זרם עקבי של חמש עד 10 פסגות לחץ על השהיה כדי לעצור זמנית את ההקלטה ולהזיז את שלב המיקרוסקופ לאזור סמוך לקצה הנגדי של שובר הכיסוי לפני חידוש ההקלטה. לאחר סריקת ארעיות הסידן על פני כל החלקת המכסה באותו אופן על פני תקופה של 10 דקות לנתח את הנתונים עם תוכנת ניתוח מעקב florescence המתאימה על פי הוראות היצרן.

פרוטוקול זה מייצר קרדיומיוציטים טהורים מאוד הרוכשים פנוטיפ דמוי מבוגרים חדרי בתרבות לאורך זמן. כפי שהוערך על ידי כתמים פלואורסצנטיים אימונו עבור isoforms MLC2 פרוזדורי חדרית, רוב התאים שנוצרו על ידי פרוטוקול זה הם פרוזדורי MLC2 isoform חיובי ביום 30 לאחר אינדוקציה של התביור הלב. בעוד isoforms MLC2 חדרית באים לידי ביטוי במספרים רבים באותו זמן נקודה.

ככל שהזמן בתרבות גדל, מתג שלם isoforms MLC2 הוא ציין. נתונים אלה אושרו גם על ידי כימות ציטומטרי זרימה של אחוז סמן MLC2 פרוזדורים חדריים המבטאים תאים. משרעת הסידן גדלה באופן משמעותי ב- iPSC-CMs ביום 90, בדומה לזה שנצפה עבור CMs עכברוש בוגר.

חשוב לציין כי זיהום תאים שאינם לב עשוי להשפיע על התבגרות תפקודית של iPSC-CMs האנושי במהלך בידול. כמו כן, כאשר שיא סידן חולף ב- iPSC-CMs יש צורך לאפשר לתאים להתייצב ב 37 מעלות צלזיוס תחת גירוי מתמיד לפחות 200 שניות, ולהגביל את ההקלטות לחלון זמן מסוים כדי להבטיח תוצאות לשחזור. זכור לאשר כי iPSCs להפגין מורפולוגיה הומוגנית כדי לאפשר לתאים לגדול ל 70 עד 80% confluency לפני תחילת התפזרות לב.

איכות טהורה בקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPS לא בוגר עשויה להראות מאפיינים פונקציונליים משתנים, שאינם משקפים את הפנוטיפ האמיתי, אך עלולים להיות מתפרשים שלא כהלכה כפנוטיפ חולה. לכן, קבלת קרדיומיוציטים טהורים ואיכותיים חשובה כדי לספק תוצאות עקביות לשחזור.