재현성은 줄기 세포 유래 심근세포를 유도할 때 주요 관심사입니다. 이러한 방법을 사용하여 고순도 및 고품질 심근세포는 기능 연구에서 사용하기 위해 iPS에서 생성될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 iPSC 유래 심근세포의 정제되고 고품질의 제제를 얻기 위한 간단하고 신뢰할 수 있고 비용 효율적이며 매우 강력한 방법입니다.
세포 패혈을 위해, PBS를 통과 배지의 1 밀리리터로 대체하기 전에 7-10 분 동안 칼슘과 마그네슘없이 PBS의 1 밀리리터로 세포를 헹구는 다. 셀 리프터를 사용하여 우물 바닥에서 세포를 부드럽게 긁어 내고 멸균 2 밀리리터 유리 파이펫을 사용하여 분리 된 세포를 기계적으로 해리시합니다. 세포가 현미경의 밑에 보이는 대로 작은 클러스터로 들어 올릴 때 1 6 비율로 세포를 분할하는 통과 매체를 추가합니다.
다음으로, 인간 배아 줄기 세포자격을 갖춘 6개의 우물 플레이트에서 흡인한다. 그런 다음 통과 배지의 1 밀리리터와 각 우물에 해리 된 세포의 1 밀리리터를 추가하고 심장 분화를 시작하기 전에 70 ~ 80 %의 합류에 도달 할 때까지 세포가 성장하게하십시오. iPSC-CM을 해리하기 최소 30분 전에 개별 유리 커버 전표를 70%에탄올로 닦고 커버 슬립을 멸균 6웰 플레이트의 개별 우물에 놓습니다.
커버 슬립이 건조되면, 인간 배아 줄기 세포의 250~300마이크로리터를 각 커버 슬립의 중앙에 직접 추가하고, 조직 배양 후드에 6개의 웰 플레이트를 놓는다. 대사적으로 선택된 iPSC-CM을 해리하기 위해 멸균 0.25%의 트립신을 각각 35°C에서 5분 동안 배양할 수 있도록 EDTA를 각각 양호하게 추가하고, 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 단일 셀 서스펜션이 달성될 때까지 세포를 기계적으로 해리시한다. 멸균 15 밀리리터 원컬 튜브에 세포를 당기고, 잘 당 RPMI 20 배지의 두 밀리리터로 각각 잘 씻어.
그런 다음 튜브에 세체를 추가하고 원심 분리에 의해 세포를 펠릿합니다. 세포 농도의 250 마이크로리터 당 5 세포에 3 배 10을 달성하기 위해 충분한 양의 매체에서 세포를 다시 중단합니다. 1000 밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 용액이 균질한 것처럼 보일 때까지 세포를 해리합니다.
그런 다음 세포의 250 마이크로리터를 1000 마이크로리터 파이펫 팁으로 흡인시키고, 용액의 전체 부피를 하나의 인간 배아 줄기 세포에 천천히 분배하여 자격을 갖춘 매트릭스 코드 커버 슬립을 한다. 모든 세포가 시드되면 하룻밤 동안 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 다음 날 아침 마다 D7 배지 2밀리리터를 부드럽게 추가합니다.
선택된 iPSC-CM이 적어도 3개월 에 도달하면 37°C에서 10분 동안 후라-2 AM의 2개의 마이크로리터로 세포를 치료하고 칼슘 분석 시스템에 전력을 공급한다. ArcLamp을 시작하고 펌프에서 적절한 입구및 콘센트 및 자극기에서 챔버에 전자 와이어에 튜브를 연결합니다. 챔버를 시스템에 배치합니다.
37섭씨 37도로 유동적인 힌감 히터를 통과하는 ProFusion 튜브를 채우고 카메라를 조정하고 조리개 치수를 조정하여 배경 영역을 최소화합니다. iPSC-CM으로 시드된 유리 커버 슬립을 챔버에 고정하고 500마이크로리터의 타이로드 용액을 커버 슬립 위에 직접 넣습니다. Tyrode의 용액을 분당 1.5 밀리리터로 조정하기 시작하고 전기 자극기를 사용하여 3~5분 동안 4밀리초마다 10볼트의 헤르츠 필드 자극으로 iPC-CM을 조정합니다.
모든 염료가 챔버 밖으로 세척되면 표지 슬립의 왼쪽 위 부위로 보기 창을 조정하고 녹음을 시작합니다. 5~10개의 피크의 일관된 스트림을 수집한 후 일시 중지를 클릭하여 일시적으로 레코딩을 중지하고 현미경 스테이지를 커버 슬립의 반대쪽 끝에 대한 인접 영역으로 이동한 후 레코딩을 재개한다. 전체 커버 슬립을 10분 동안 동일한 방식으로 스캔한 후 제조업체의 지시에 따라 적절한 플로레시세스 추적 분석 소프트웨어로 데이터를 분석합니다.
이 프로토콜은 시간이 지남에 따라 배양에서 심실, 성인과 같은 표현형을 획득하는 매우 순수한 심근세포를 생성합니다. 심방 및 심실 MLC2 등색에 대한 면역 형광 염색에 의해 평가된 바와 같이, 이 프로토콜에 의해 생성된 세포의 대부분은 심방 MLC2 이소형 양성이어서 30일째에 심장 분화의 유도 후 양성이다. 심실 MLC2 동소형은 동시에 많은 숫자로 표현됩니다.
배양 시간이 증가함에 따라 MLC2 등소로의 완전한 전환이 관찰됩니다. 이들 데이터는 또한 세포를 발현하는 심방 및 심실 MLC2 마커의 백분율의 흐름 세포 측정 정량화에 의해 확인되었다. 칼슘 진폭은 성인 쥐 CM에 대해 관찰된 것과 유사한 90일째에 iPSC-CM에서 현저하게 증가합니다.
비 심장 세포를 오염시키는 것은 분화 도중 인간 iPSC-CM의 기능적인 성숙에 영향을 미칠 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 또한 iPSC-CM에서 칼슘 과도를 기록할 때 세포가 섭씨 37도에서 적어도 200초 동안 일정한 자극으로 안정화되도록 하고, 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 기록을 특정 시간 창으로 제한할 필요가 있다. iPSCs가 동질적인 형태를 나타내고 세포가 심장 분화를 시작하기 전에 70 ~80%의 합류로 성장할 수 있도록 하는 것을 기억하십시오.
미성숙 iPS 유래 심근세포의 순수한 품질은 실제 표현형을 반영하지 않는 변경된 기능적 특성을 나타낼 수 있지만 병은 표현형으로 잘못 해석될 수 있습니다. 따라서 순수하고 고품질의 심근세포를 얻는 것은 일관되고 재현 가능한 결과를 제공하는 것이 중요합니다.
