Este protocolo descreve uma técnica para direcionar drogas de interesse para macrófagos de zebrafish larval para manipular e avaliar a função macrófago. Esta técnica tem vantagens sobre as estratégias tradicionais de entrega de medicamentos, como a imersão, garantindo que os medicamentos sejam especificamente direcionados a macrófagos através do encapsulamento lipossomo. Quando aplicada a modelos de zebrafish da doença com componente inflamatório, essa técnica tem o potencial de resolver como macrófagos contribuem para processos patológicos.
Aqui, demonstramos a utilidade desta técnica mirando uma droga inibidora de oxigênio mitocondrial-reativa aos macrófagos para suprimir a ativação. A microinjeção de lipossomos carregados de drogas em larvas pode ser desafiadora, pois deve-se tomar cuidado para não causar danos epiteliais excessivos, influenciando potencialmente estudos imunológicos. A demonstração visual deste protocolo é importante porque envolve metodologias farmacológicas e células vivas animais inteiras que podem não ser realizadas rotineiramente em um único laboratório.
Para preparar 10 miligramas de lipossomos em um frasco de fundo redondo de 25 mililitros, adicione 31 nanomolars de azul marinho e 300 nanomolars de uma droga mitocondrial-reativa de oxigênio inibidor do frasco. Sonicar brevemente para dissolver completamente, e remover o solvente lentamente em um evaporador rotativo definido sobre um banho de água Celsius de 45 graus a 75 rotações por minuto sob pressão de vácuo. Quando um filme fino lipídio seco se formou dentro das paredes de vidro do frasco, seque ainda mais o filme por 45 minutos sob nitrogênio para facilitar a remoção completa do solvente orgânico.
Em seguida, hidrate o filme com um mililitro de PBS, e sele o frasco com filme de parafina antes de agitar o frasco à mão sobre um banho de água de 60 graus Celsius por 20 minutos. Após sete ciclos de congelamento e descongelamento, use uma mini-extrusora e membranas de policarbonato gravadas de um micrômetro para extrusão dos lipossos por dois a seis ciclos. Quando grandes vesículas unilamellar foram obtidas, condensar os lipossomos frescos em uma pelota por ultracentrifugação.
Incubar a pelota com um mililitro de solução 1%poloxamer 188 por 30 minutos a 45 graus Celsius e 750 rotações por minuto em um ThermoMixer com um acessório de tubo microcentrifuuge de dois mililitros. Durante a pós inserção do poloxamer 188 nos lipossomos, a concentração correta do poloxamer, o tempo de incubação e a temperatura são importantes para alcançar as características físico-químicas ideais dos lipossomos resultantes. No final da incubação, ultracentrize a mistura novamente sob as mesmas condições centrífugas, e remova o sobrenatante contendo qualquer polímero ou droga não ligada.
Em seguida, armazene as pelotas lipossópicas a quatro graus Celsius, protegidas da luz. Para determinar o tamanho e o potencial zeta dos lipossomos, diluir a formulação lipossa com água ultrauso em uma proporção de 1 a 100. Use um analisador dinâmico de dispersão de luz para medir o tamanho das partículas, índice de polidispersidade e potencial de zeta em triplicado a 25 graus Celsius.
Para calcular a eficiência da armadilha e o carregamento de drogas dos lipossomos, dissolva os lipossomos em Triton X-100. Injete 20 microliters da amostra de lipossomo dissolvido em um sistema de cromatografia líquida de alta pressão com uma bomba quaternária, um detector de matriz de diodo fixado em 230 nanômetros, e uma coluna de três micrômetros, 250 vezes 4,6 milímetros. Para preparar larvas transgênicas de zebrafish para a injeção, use fórceps de ponta fina para descorionato manualmente 30 horas pós-fertilização embriões, e permitir que os embriões se desenvolvam a 28,5 graus Celsius até dois dias após a fertilização.
Quando os embriões chegarem ao estágio apropriado, diluir uma formulação liposa recém-preparada em uma proporção de um para um em PBS estéril, e misturar a solução por dois a três segundos por vórtice. Despeje celulose de 3%de metila suficiente no meio E3 na tampa de uma pequena tampa de prato de cultura de 35 milímetros para formar uma película fina cobrindo toda a superfície. Use uma pipeta de transferência de plástico para coletar uma piscina de aproximadamente 20 a 25 larvas anestesiadas.
Deixe os embriões se concentrarem na ponta da pipeta por gravidade, e transfira cuidadosamente as larvas para o meio da tampa de prato de cultura de 35 milímetros com solução mínima. Use um carregador microcapilar para organizar as larvas com seus anteriores em direção ao topo da placa de injeção com a superfície dorsal voltada para a agulha de microinjeção para injeção no ventrículo do cérebro traseiro ou com seus anteriores em direção à esquerda da placa de injeção com as superfícies ventral voltadas para a agulha de microinjeção para injeção no venoso sinusal. Use um carregador microcapilário para encher uma agulha de injeção com aproximadamente cinco microliters da mistura de injeção liposesome.
Monte a agulha em um micromanípulo conectado a um suporte magnético e um injetor de pressão, e posicione a configuração sob um microscópio estéreo. Use fórceps limpos e finos para cortar a ponta da agulha de microinjeção para gerar uma abertura de aproximadamente cinco micrômetros de diâmetro. Coloque o injetor em uma duração de pulso de aproximadamente 50 milissegundos e uma pressão de injeção de aproximadamente 40 libras por polegada quadrada.
Injete um bolus em uma gota de óleo mineral posicionado sobre as linhas de rede de um hemótmetro para calibrar o volume a ser injetado. Em seguida, ajuste a duração do pulso e/ou a pressão de injeção até que o diâmetro do bolus cubra 2 1/2 das menores linhas de grade. Injete cuidadosamente um nanoliter da mistura de injeção de lipossomo no ventrículo de cérebro traseiro de cada larva.
Imediatamente após as injeções, adicione e3 médio à placa de injeção e use uma pipeta de transferência de plástico para agitar suavemente as larvas da celulose de metila. Para visualizar a superfície dorsal do cérebro traseiro em um microscópio confocal equipado com uma lente de imersão de água, primeiro preencha um prato de cultura de 35 milímetros a uma profundidade de cinco milímetros com meio de montagem, e deixe o polimerizar médio. Escavar uma pequena trincheira na área de agarose de área suficiente para acomodar o saco de gema do embrião experimental, e use uma pipeta de transferência de plástico cheia de meio de montagem derretida para coletar uma larva anestesiada.
Deposite imediatamente a larva no prato de cultura, e use um carregador microcapilário para orientar o lado ventral do saco de gema para baixo nos orifícios escavados. Mantenha o embrião nesta posição até que a agarose polimerize. Sobreponha o embrião com e3 médio suplementado com 200 microgramas por mililitro de tricaine.
Para viver a imagem do ventrículo de cérebro traseiro, selecione o objetivo de 20x e defina o microscópio confocal para 512 por 512 pixels e um zoom de 2,5x. Quando os parâmetros do microscópio tiverem sido definidos, adquira pilhas Z de 40 por três micrômetros que se estendem da superfície dorsal-mais dorsal do cérebro traseiro usando imagens de dois canais para imagem dos lipossomos fluorescentes azuis e macrófagos fluorescentes verdes. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, carregue os arquivos em um programa de software de análise de imagem 3D apropriado.
Na guia Medição, arraste o protocolo Encontrar objetos para o espaço Arrastar tarefas aqui para fazer medidas. Selecione o canal DAPI para destacar os lipossomos e arraste a ferramenta Inspecionar através das seções Z para detectar os macrófagos carregados de liposomino. Para quantificar a intensidade de fluorescência dos lipossomos dentro das células individuais, arraste o protocolo Clip To Regions Of Interest para o espaço Drag Tasks Here To Make Measurements, e use a ferramenta Retângulo para desenhar uma caixa em torno da célula de interesse nas dimensões X, Y e Z.
Em seguida, selecione Fazer item de medição no menu suspenso de medidas para gerar um arquivo de medição na janela da biblioteca. Nesta tabela, o tamanho, o potencial zeta, o carregamento de drogas e a eficiência da armadilha dos lipossomos produzidos são resumidos. Como observado, o tamanho das partículas dos lipossomos é semelhante com e sem carregamento de drogas, embora a carga superficial de lipossomos carregados de drogas seja ligeiramente mais neutra do que os lipossomos de controle apenas com azul marinho.
A microinjeção de lipossomos de rótulo azul marinho no ventrículo de cérebro traseiro, como demonstrado, resulta em uma rápida absorção por macrófagos residentes que podem ser facilmente quantificados por microscopia confocal por três horas após a injeção. Os neutrófilos, no entanto, raramente são observados para conter lipossomos intracelulares. Dentro de macrófagos carregados de liposomos individuais, os lipossomos se acumulam dentro dos compartimentos fagorólises, o que é necessário para a degradação lipossóica e posterior liberação do conteúdo de drogas no citoplasma.
A entrega no sus venosus pode entregar os lipossomos para macrófagos hematopoiéticos caudais residentes em tecido através da circulação. A microinjeção de lipossomos carregados com a droga inibidora de oxigênio mitocondrial-reativa no ventrículo de cérebro traseiro pode suprimir significativamente a produção de espécies de oxigênio mitocondrial-reativas movidas a monossódico dentro de macrófagos residentes em cérebros traseiros carregados de liposomos. A validação adicional dos efeitos supressivos de drogas de interesse nos estados de ativação do macrófago pode ser realizada investigando a expressão genética de citocinas proinflammatórias por toda a montagem in situ hibridização e o recrutamento temporal de neutrófilos.
Usando esta técnica, conseguimos direcionar drogas para macrófagos para confirmar que um mecanismo imunometabólico impulsiona sua ativação em um modelo de zebrafish larval de inflamação aguda de gouty. Adaptações futuras deste protocolo podem incluir a realização de modificações superficiais do lipossomo para melhorar a segmentação de macrófagos ou promover o direcionamento para outras células imunes, como neutrófilos.
