监测斑马鱼幼虫的靶向信号反应 - Z-REX 揭示亲电药物和代谢物的精确机制

因此，利用Z-REX，研究人员可以询问个体信号反应如何改变，以响应在斑马鱼幼虫近生理条件下与感兴趣的特定蛋白质接触的特定反应配体。常规方法如大剂量反应性小分子引起靶标和毒性，并且不能控制配体靶标特异性。Z-REX可以以高时空精度将特定的配体靶标接合与特定的表型联系起来。

我们最近展示了反应性代谢物HNE如何（Z-REX发现的相关靶点和途径）能够开发针对三阴性乳腺癌的精确亚型特异性激酶抑制剂。首先将胚胎对准装有新鲜10%Hank平衡盐溶液或HBSS的注射板的凹槽中。将针尖浸入培养基中，如果需要，施加注射脉冲以去除尖端中的气泡 对于注射胚胎，请一次移动穿透绒毛膜和卵黄囊并施加注射脉冲。

注射其他胚胎后，使用喷瓶将它们冲洗到含有新鲜HBSS培养基的新培养皿中。将未注射的胚胎汇集到另一个板中。要进行Z-REX治疗分析，首先将注射的胚胎分配到10厘米的培养皿中。

在有红光的黑暗房间里，用30毫升10%HBSS替换培养基，有或没有一微摩尔的REX探针。在黑暗中将胚胎在28.5摄氏度下孵育。受精后30小时，在黑暗中更换培养基。

重复孵育和更换培养基两次后，将胚胎暴露在每30秒旋转一次的预热紫外线灯的光线下。为了进行表型测定，从包含麻醉胚胎的平板中取出未受精或死亡的胚胎。使用锋利的镊子，取出胚胎的绒毛膜。

将胚胎安装在用10%HBSS培养基制备的2%琼脂糖平板上，并在体视显微镜下观察。使用 ImageJ 计数每条鱼的中性粒细胞和巨噬细胞数量。选择"徒手选择"并圈出整条鱼，然后选择"查找千里马"选项以计数荧光细胞 在本研究中，Z-REX处理的胚胎显示出中性粒细胞和巨噬细胞的损失。

这种效应在未治疗组中不存在。在Halo-P2A-Keap1组中未触发细胞凋亡信号通路，导致巨噬细胞和中性粒细胞水平未改变。在对HNE没有反应的Halo-TEV-Keap1突变体中也观察到了类似的结果。

转录和实时定量PCR分析显示，Z-REX后免疫相关基因下调，抗氧化基因上调。免疫荧光染色显示，P2A分裂构建体的HA标签是TeV融合构建体的两倍，表明表达水平相似。野生型和突变型Halo-TeV-Keap1的表达水平也相似。

在Z-REX处理的转基因中性粒细胞报告系中，还观察到中性粒细胞和活性半胱天冬酶3的共定位。最重要的是正确设置您的文档。限制将真正改善您的结果。

我们采用了Z-REX，这是一个名为Localis-REX的药物筛选平台的想法。到目前为止，还没有其他技术能够实现这种局部特异性和反应性配体或靶标映射。它帮助我们开发了用于治疗乳腺癌的亲电候选药物。

鉴于局部信号在癌症、免疫学、衰老等许多领域的重要性日益增加，Z-Rex是唯一能够绘制局部反应性配体定向事件的工具，有望帮助许多领域。