このプロトコルは、マクロファージ機能を操作および評価するために、幼虫ゼブラフィッシュマクロファージに関心のある薬物を標的とする技術を記述する。この技術は、薬物がリポソームカプセル化を介してマクロファージを特異的に標的にされることを保証することによって浸漬などの従来の薬物送達戦略よりも利点がある。炎症性成分を有する疾患のゼブラフィッシュモデルに適用すると、この技術は、マクロファージが病理学的プロセスにどのように寄与するかを解決する可能性を秘めている。
ここでは、ミトコンドリア活性酸素種阻害薬をマクロファージに標的化して活性化を抑制することにより、この技術の有用性を実証する。薬物を装填したリポソームを幼虫に微量に注射することは、過度の上皮損傷を引き起こさないように注意する必要があり、免疫学的研究に影響を与える可能性があるため、困難な場合があります。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、単一の実験室で日常的に行われない可能性のある薬理学的および全動物の生細胞方法論を含むため重要である。
25ミリリットルの丸底フラスコに10ミリグラムのリポソームを調製するには、31ナノモルの海洋青と300ナノモルのミトコンドリア反応性酸素種阻害薬をフラスコに加える。完全に溶解するために短時間超音波処理し、真空圧力下で毎分75回転で45°Cの水浴に設定されたロータリーエバポレーターでゆっくりと溶媒を除去します。フラスコのガラス壁内に乾燥した薄膜が形成された場合、さらに窒素下でフィルムを45分間乾燥させて有機溶媒の完全除去を容易にする。
次に、フィルムをPBSの1ミリリットルで水和し、フラスコを60°Cの水浴で手で20分間攪拌する前にパラフィンフィルムで密封する。凍結と解凍の7サイクル後、ミニ押出機と1マイクロメートルのトラックエッチングポリカーボネート膜を使用して、リポソームを2〜6サイクル押し出します。大きなユニラメラ小胞が得られたら、新鮮なリポソームを超遠心分離によってペレットに凝縮する。
2ミリリットルのマイクロ遠心分離管付着体を備えたThermoMixerで、1%ポロクサマー188溶液1ミリリットルを摂氏45度で30分、毎分750回転でペレットをインキュベートします。ポロクサマー188をリポソームに挿入した後、得られるリポソームの最適な物理化学的特性を達成するためには、正しいポロクサマー濃度、インキュベーション時間、および温度が重要である。インキュベーションの終わりに、同じ遠心分離機条件下で再び混合物を超遠心分離し、任意の非結合ポリマーまたは薬物を含む上清を除去する。
その後、光から保護された摂氏4度でリポソームペレットを保存します。リポソームの大きさとゼータ電位を決定するには、リポソーム製剤を超純水で1対100の比率で希釈します。ダイナミック光散乱分析装置を使用して、粒子径、多分散指数、および摂氏25度の三重位のゼータ電位を測定します。
リポソームの捕捉効率と薬物負荷を計算するには、トリトンX-100にリポソームを溶解する。溶解したリポソームサンプルの20マイクロリットルを、4次ポンプ、230ナノメートルに設定されたダイオードアレイ検出器、3マイクロメートル、250倍4.6ミリメートルのカラムを備えた高圧液体クロマトグラフィーシステムに注入します。注射のためにトランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫を準備するには、細かい先端鉗子を使用して受精後30時間の胚を手動でデコールし、受精後2日まで胚を摂氏28.5度で発達させる。
胚が適切な段階に達したら、作製したリポソーム製剤を滅菌PBSで1対1の比率で希釈し、ボルテックスで溶液を2〜3秒間混合する。E3培地に3%のメチルセルロースを小さな35ミリメートルの培養皿蓋の蓋に注ぎ、表面全体を覆う薄膜を形成します。プラスチックトランスファーピペットを使用して、約20〜25個の麻酔幼虫のプールを収集します。
胚が重力によってピペットの先端に集中できるようにし、幼虫を最小限の溶液で35ミリメートル培養皿蓋の真ん中に慎重に移します。マイクロキャピラリーローダーを使用して、後脳心室への注射のためにマイクロインジェクション針に向かって後側表面を向いた後側表面、または腹側表面が静脈内静脈内注射針に向かって向いている前部を持つ注射板の上部に向かって幼虫を配置します。マイクロキャピラリーローダーを使用して、リポソーム注射ミックスの約5マイクロリットルで注射針をバックフィルします。
磁気スタンドと圧力インジェクターに接続されたマイクロマニピュレータに針を取り付け、立体顕微鏡の下に設置します。マイクロインジェクション針の先端を切断して直径約5マイクロメートルの開口部を生成するために、清潔で細かい先端の鉗子を使用してください。インジェクタを約 50 ミリ秒のパルス持続時間と、1 平方インチあたり約 40 ポンドの射出圧力に設定します。
水細胞計のグリッドライン上に位置する鉱物油の滴にボーラスを注入し、注入する体積を較正します。次に、ボーラスの直径が最小グリッド線の2 1/2を覆うまでパルス持続時間および/または射出圧力を調整します。各幼虫の後脳心室にリポソーム注射ミックスの1ナノリットルを慎重に注入する。
注射の直後に、注入プレートにE3培地を加え、プラスチック転写ピペットを使用して、メチルセルロースから幼虫を軽く攪拌します。水浸水レンズを搭載した共焦点顕微鏡上の後脳の後頭面を画像化するには、まず35ミリメートル培養皿を取り付け媒体で5ミリメートルの深さまで満たし、培地を重合させます。実験胚の黄身嚢を収容するのに十分な面積のアガロースに小さなトレンチを掘削し、溶融した取り付け媒体で満たされたプラスチック転写ピペットを使用して麻酔幼虫を採取する。
すぐに幼虫を培養皿に堆積させ、マイクロキャピラリーローダーを使用して、黄身嚢腹側を掘削された穴に向けます。アガロースが重合するまで、この位置に胚を維持します。トリケーヌのミリリットル当たり200マイクログラムを添加したE3培地で胚をオーバーレイする。
後脳心室を生画像化するには、20xの目的を選択し、共焦点顕微鏡を512 x 512ピクセルと2.5倍ズームに設定します。顕微鏡パラメータを設定すると、2チャンネルイメージングを使用して後脳の最表面の最下方面から延びる40x3マイクロメートルのZスタックを取得し、青色蛍光リポソームおよび緑色蛍光マクロファージを画像化します。すべての画像が取得されたら、適切な3D画像解析ソフトウェアプログラムにファイルをロードします。
[計測]タブで、[オブジェクトを検索]プロトコルをドラッグして[ここでタスクをドラッグして測定を行う]スペースにドラッグします。DAPI チャネルを選択してリポソームをハイライトし、Z セクションを通して検査ツールをドラッグしてリポソームを含むマクロファージを検出します。個々のセル内のリポソームの蛍光強度を定量化するには、[対象領域にクリップ] プロトコルをドラッグして [ドラッグ タスクを計測] スペースにドラッグし、[矩形] ツールを使用して X、Y、Z の各次元の対象セルの周囲にボックスを描画します。
次に、[計測]ドロップダウンメニューから[計測項目を作成]を選択して、ライブラリウィンドウに計測ファイルを生成します。この表では、生産されたリポソームのサイズ、ゼータ電位、薬物負荷、および封入効率が要約される。観察されるように、リポソームの粒径は薬物負荷の有無にかかわらず類似しているが、薬物を含むリポソームの表面電荷は海洋青色のみで対照リポソームよりもわずかに中性である。
後脳心室への海洋青色標識リポソームのマイクロインジェクションは、示されているように、注射後3時間で共焦点顕微鏡によって容易に定量することができる常駐マクロファージによる急速な取り込みをもたらす。しかし、好中球は細胞内リポソームを含むことはほとんど観察されない。個々のリポソームを含むマクロファージ内では、リポソームは、細胞質へのリポソーム分解およびその後の薬物含有量の放出に必要な貪食室内に蓄積する。
静脈内の静脈への送達は循環を介して尾口造血組織居住マクロファージにリポソームを送達することができる。ミトコンドリア活性酸素種阻害薬を投与したリポソームを後脳心室に微量注射すると、リポソームを含む後脳居住マクロファージ内での単ナトリウムウレートウレート結晶駆動のミトコンドリア反応性酸素種の産生を有意に抑制できる。マクロファージ活性化状態に対する目的の薬物の抑制効果のさらなる検証は、その一方での全マウントによる炎症性サイトカイン遺伝子発現および好中球の一時的な募集を調べることによって行うことができる。
この技術を用いて、マクロファージに薬物を標的にして、免疫代謝機構が急性痛風炎症の幼虫ゼブラフィッシュモデルで活性化を促進することを確認することができました。このプロトコルの将来の適応は、マクロファージターゲティングを強化するためにリポソームの表面改変を行うか、好中球のような他の免疫細胞への標的を促進することを含むことができる。
