Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Gezielten Ausrichtung von Arzneimitteln auf Larvenzebrafische Makrophagen, um die Makrophagenfunktion zu manipulieren und auszuwerten. Diese Technik hat Vorteile gegenüber traditionellen Arzneimittelabgabestrategien wie Immersion, indem sichergestellt wird, dass die Medikamente durch Liposomenverkapselung gezielt auf Makrophagen ausgerichtet sind. Wenn diese Technik auf Zebrafischmodelle von Krankheiten mit einer entzündlichen Komponente angewendet wird, hat sie das Potenzial zu klären, wie Makrophagen zu pathologischen Prozessen beitragen.
Hier demonstrieren wir den Nutzen dieser Technik, indem wir ein mitochondrial-reaktives Sauerstoffspezies-hemmendes Medikament auf Makrophagen zielen, um die Aktivierung zu unterdrücken. Die Mikroinjektion von medikamentösem Liposomen in Larven kann eine Herausforderung sein, da darauf geachtet werden sollte, keine übermäßigen Epithelschäden zu verursachen, die möglicherweise immunologische Studien beeinflussen. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist wichtig, da es pharmakologische und ganze Tier-Livezellmethoden umfasst, die nicht routinemäßig in einem einzigen Labor durchgeführt werden können.
Um 10 Milligramm Liposomen in einem 25-Milliliter-Rundkolben zuzubereiten, fügen Sie dem Kolben 31 Nanomolaren Meerblau und 300 Nanomolaren eines mitochondrial-reaktiven Sauerstoffspezies-hemmenden Medikaments hinzu. Beschallen Sie kurz, um sich vollständig aufzulösen, und entfernen Sie das Lösungsmittel langsam auf einem Rotationsverdampfer, der über einem 45-Grad-Celsius-Wasserbad bei 75 Umdrehungen pro Minute unter Vakuumdruck gesetzt ist. Wenn sich in den Glaswänden des Kolbens ein trockener Lipid-Dünnfilm gebildet hat, trocknen Sie den Film 45 Minuten unter Stickstoff weiter, um die vollständige Entfernung des organischen Lösungsmittels zu erleichtern.
Als nächstes hydratisieren Sie den Film mit einem Milliliter PBS und versiegeln Sie den Kolben mit Paraffinfolie, bevor Sie den Kolben 20 Minuten lang mit der Hand in ein 60-Grad-Wasserbad mit 60 Grad Celsius aufbereiten. Nach sieben Zyklen des Einfrierens und Auftauens verwenden Sie einen Miniextruder und ein Mikrometer track-geätzte Polycarbonat-Membranen, um die Liposomen für zwei bis sechs Zyklen zu extrudieren. Wenn große unilamellare Vesikel erhalten wurden, kondensieren Sie die frischen Liposomen durch Ultrazentrifugation zu einem Pellet.
Inkubieren Sie das Pellet mit einem Milliliter 1%Poloxamer 188 Lösung für 30 Minuten bei 45 Grad Celsius und 750 Umdrehungen pro Minute in einem ThermoMixer mit einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohraufsatz. Während der Post-Einfügung von Poloxamer 188 in die Liposomen sind die richtige Poloxamerkonzentration, Inkubationszeit und Temperatur wichtig, um die optimalen physikalisch-chemischen Eigenschaften der resultierenden Liposomen zu erreichen. Am Ende der Inkubation, ultrazentrifugieren Sie das Gemisch wieder unter den gleichen Zentrifugenbedingungen, und entfernen Sie den Überstand enthalten alle ungebundenen Polymer oder Medikament.
Dann lagern Sie die Liposomenpellets bei vier Grad Celsius, vor Licht geschützt. Um die Größe und das Zeta-Potenzial der Liposomen zu bestimmen, verdünnen Sie die Liposomenformulierung mit reinem Reinstwasser im Verhältnis eins zu 100. Verwenden Sie einen dynamischen Lichtstreuungsanalysator, um die Partikelgröße, den Polydispersitätsindex und das Zeta-Potenzial in Dreifacharbeit bei 25 Grad Celsius zu messen.
Um die Einschlusseffizienz und die Medikamentenbelastung der Liposomen zu berechnen, lösen Sie die Liposomen in Triton X-100 auf. Injizieren Sie 20 Mikroliter der gelösten Liposomenprobe in ein Hochdruck-Flüssigkeitschromatographiesystem mit einer Quaternärpumpe, einem Dioden-Array-Detektor auf 230 Nanometer und einer Drei-Mikrometer-, 250-mal-4,6-Millimeter-Säule. Um transgene Zebrafischlarven für die Injektion vorzubereiten, verwenden Sie Feinspitzenzangen, um 30 Stunden nach der Befruchtung Embryonen manuell zu dechorisieren und die Embryonen bis zwei Tage nach der Befruchtung bei 28,5 Grad Celsius entwickeln zu lassen.
Wenn die Embryonen das entsprechende Stadium erreicht haben, verdünnen Sie eine frisch zubereitete Liposomenformulierung im Eins-zu-Eins-Verhältnis in sterilem PBS und mischen Sie die Lösung zwei bis drei Sekunden durch Wirbeln. Gießen Sie genügend 3%Methylcellulose in E3-Medium in den Deckel eines kleinen 35-Millimeter-Kulturschalendeckels, um einen dünnen Film zu bilden, der die gesamte Oberfläche bedeckt. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um einen Pool von etwa 20 bis 25 anästhesierten Larven zu sammeln.
Lassen Sie die Embryonen an der Spitze der Pipette durch Schwerkraft konzentrieren, und übertragen Sie die Larven vorsichtig in die Mitte des 35-Millimeter-Kulturschalendeckels mit minimaler Lösung. Verwenden Sie einen Mikrokapillarlader, um die Larven mit ihren Vorderteilen zur Oberseite der Injektionsplatte zu ordnen, wobei die dorsale Oberfläche zur Injektion in den Hinterhirnventrikel oder mit ihren Vorderteilen links von der Injektionsplatte mit den ventralen Oberflächen zur Mikroinjektionsnadel zur Injektion in den Sinusvenosus gerichtet ist. Verwenden Sie einen Mikrokapillarlader, um eine Injektionsnadel mit etwa fünf Mikrolitern der Liposomen-Injektionsmischung zu füllen.
Montieren Sie die Nadel in einen Mikromanipulator, der mit einem magnetischen Ständer und einem Druckinjektor verbunden ist, und positionieren Sie das Setup unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie saubere, feine Zangen, um die Spitze der Mikroinjektionsnadel zu schneiden, um eine Öffnung von etwa fünf Mikrometern Durchmesser zu erzeugen. Stellen Sie den Injektor auf eine Pulsdauer von ca. 50 Millisekunden und einen Injektionsdruck von etwa 40 Pfund pro Quadratzoll ein.
Injizieren Sie einen Bolus in einen Tropfen Mineralöl, der über den Gitterlinien eines Hämozytometers positioniert ist, um das zu injizierende Volumen zu kalibrieren. Passen Sie dann die Pulsdauer und/oder den Einspritzdruck an, bis der Durchmesser des Bolus 2 1/2 der kleinsten Rasterlinien abdeckt. Einen Nanoliter der Liposomen-Injektionsmischung vorsichtig in die Hinterhirn-Herzkammer jeder Larve injizieren.
Unmittelbar nach den Injektionen E3 medium auf die Injektionsplatte geben und eine Kunststoff-Transferpipette verwenden, um die Larven aus der Methylcellulose sanft zu rühren. Um die dorsale Oberfläche des Hinterhirns auf einem konfokalen Mikroskop mit einer Wassertauchlinse abzubilden, füllen Sie zunächst eine 35-Millimeter-Kulturschale bis zu einer Tiefe von fünf Millimetern mit Montagemedium und lassen das Medium polymerisieren. Graben sie, einen kleinen Graben in der Agarose von ausreichender Fläche, um den Dottersack des experimentellen Embryos unterzubringen, und verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit geschmolzenem Montagemedium gefüllt, um eine anästhesierte Larve zu sammeln.
Legen Sie die Larve sofort in die Kulturschale ab und orientieren Sie die Dottersac-Ventralseite mit einem Mikrokapillarlader in die ausgehobenen Löcher. Halten Sie den Embryo in dieser Position, bis die Agarose polymerisiert. Überlagern Sie den Embryo mit E3-Medium, ergänzt um 200 Mikrogramm pro Milliliter Tricain.
Um die Hinterhirnkammer live abzubilden, wählen Sie das 20-fache Objektiv aus, und stellen Sie das konfokale Mikroskop auf 512 x 512 Pixel und einen 2,5-fachen Zoom ein. Wenn die Mikroskopparameter festgelegt sind, erfassen Sie 40 mal drei Mikrometer Z-Stacks, die sich von der dorsal-meisten Oberfläche des Hinterhirns aus mit Hilfe von Zweikanal-Bildgebung erstrecken, um die blauen fluoreszierenden Liposomen und grünen fluoreszierenden Makrophagen abzubilden. Wenn alle Bilder erhalten sind, laden Sie die Dateien in ein entsprechendes 3D-Bildanalyse-Softwareprogramm.
Ziehen Sie unter der Registerkarte Messen das Protokoll Objekte suchen in die Drag Tasks hier, um Werte zu erstellen. Wählen Sie den DAPI-Kanal aus, um die Liposomen hervorzuheben, und ziehen Sie das Werkzeug Inspect durch die Z-Abschnitte, um die liposomengeladenen Makrophagen zu erkennen. Um die Fluoreszenzintensität von Liposomen innerhalb der einzelnen Zellen zu quantifizieren, ziehen Sie das Protokoll Clip to Regions Of Interest in das Drag Tasks Here To Make Measurements Space, und verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um ein Feld um die Zelle zu zeichnen, die für die X-, Y- und Z-Bemaßung von Interesse ist.
Wählen Sie dann im Dropdownmenü Messungen die Option Messelement erstellen aus, um eine Messdatei im Bibliotheksfenster zu generieren. In dieser Tabelle werden die Größe, das Zetapotenzial, die Belastung und die Einschlusseffizienz der produzierten Liposomen zusammengefasst. Wie beobachtet, ist die Partikelgröße der Liposomen mit und ohne Medikamentenbelastung ähnlich, obwohl die Oberflächenladung von medikamentösen Liposomen etwas neutraler ist als die Kontrollliposomen nur mit Marineblau.
Die Mikroinjektion von marinen blau markierten Liposomen in die Hinterhirnkammer führt, wie gezeigt, zu einer schnellen Aufnahme durch gebietsansässige Makrophagen, die durch konfokale Mikroskopie durch drei Stunden nach der Injektion leicht quantifiziert werden können. Neutrophile werden jedoch selten beobachtet, um intrazelluläre Liposomen zu enthalten. Innerhalb einzelner liposomenhaltiger Makrophagen akkumulieren sich die Liposomen in den phagolysosomalen Kompartimenten, was für den Liposomenabbau und die anschließende Freisetzung des Wirkstoffgehalts in das Zytoplasma notwendig ist.
Die Abgabe in den Sinus venosus kann die Liposomen über die Zirkulation an kaudalhäche hämatopoetische Gewebe-Resident-Makrophagen liefern. Die Mikroinjektion von Liposomen, die mit dem mitochondrial-reaktiven Sauerstoffspezies-hemmenden Medikament in die Hinterhirn-Herzkammer geladen sind, kann die Produktion von Mononatrium-Urate-Kristall-getriebenen mitochondrial-reaktiven Sauerstoffspezies in liposome-beladenen Hinterhirn-Resident-Makrophagen signifikant unterdrücken. Eine weitere Validierung der unterdrückenden Wirkungen von Arzneimitteln von Interesse auf Makrophagenaktivierungszustände kann durch Die Untersuchung der proinflammatorischen Zytokin-Genexpression durch gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung und die zeitliche Rekrutierung von Neutrophilen durchgeführt werden.
Mit dieser Technik konnten wir Medikamente auf Makrophagen zielen, um zu bestätigen, dass ein immunmetabolischer Mechanismus ihre Aktivierung in einem Larven-Zebrafischmodell einer akuten Gichtentzündung antreibt. Zukünftige Anpassungen dieses Protokolls könnten die Durchführung einer Oberflächenmodifikation des Liposoms umfassen, um das Makrophagen-Targeting zu verbessern oder das Targeting auf andere Immunzellen wie Neutrophile zu fördern.
