该协议提出了一种易于执行的方法，用于培育由链球菌组成的跨王国生物膜。穆坦人和坎迪达阿尔比坎人。随后的基于共分显微镜的pH比率测量允许准确监测这些生物膜的细胞外基质内的pH发展。
仔细选择图像采集参数对于获取具有足够对比度的图像数据进行后续分析至关重要。pH 比率测量是一种快速、精确、廉价的实时研究跨王国生物膜中水平和垂直 pH 梯度的方法。pH 比率也可以在纯真菌和细菌生物膜中进行。
该方法有助于增进我们对生物膜中微生物代谢的理解。展示生物膜生长过程将是阿内特·阿贾尔·汤姆森，一个技术员从我的实验室。在有氧条件下，在37摄氏度的血脂盘上生长S.mutans和C.albicans。
然后将每个生物体的单菌体转移到充满5毫升脑心输液的试管中，再生长18个小时。第二天，将培养物在1200次g下离心5分钟，然后丢弃上一代。在生理盐水中重新消耗细胞，并调整OD 550到0.5为C.albicans和S.mutans。
然后稀释S.mutans悬浮液1至10，以达到等值浓度。将50微升无菌唾液滴入光学底部96孔板的孔中进行显微镜检查。在37摄氏度下孵育板30分钟，然后用100微升无菌生理盐水洗三次，并排空井。
在每个井中加入100微升的C.albicans悬浮液，在37摄氏度下孵育板90分钟，然后用盐水洗井三次。接下来，在每一个井中加入100微升热灭活的胎儿牛血清。孵育盘子两小时，然后用盐水洗三次。
清空油井，但留下一个20微升的储层，以避免过度的剪切力。在每个井中加入 100 微升的 S.mutans 悬浮液和 150 微升的 BHI，每井加 5% 蔗糖。然后在37摄氏度下孵育板24小时或更长时间。
培养较老的生物膜时，每天更换介质。在跨王国生长阶段结束时，用无菌生理盐水洗盘子五次。对于比位 pH 成像，请使用带 63X 油或水浸透镜、543 纳米激光线和光谱成像系统的倒置共声激光扫描显微镜。
使用培养箱将显微镜加热到 35 摄氏度。设置检测器，用于同时检测绿色荧光从 576 到 608 纳米，红色荧光从 629 到 661 纳米。然后选择适当的激光功率和增益，以避免过度和曝光不足。
将针孔大小设置为一个空气单元或约 0.8 微米的光学片。然后将图像大小设置为 512 x 512 像素，将扫描速度设置为 2。使用均值选项选择 2 的线平均值。
准备100微升无菌生理盐水，0.4%葡萄糖滴定到pH7。然后制作C-SNARF-4的库存溶液，并将染料加入30微摩尔的最终浓度。用跨王国生物膜空空一口，留下一个20微升的储液罐，然后加入葡萄糖和比例染料的盐水。
将板放在显微镜舞台上并开始成像。在 35 摄氏度下，以 0.2 pH 单位的增量准备一系列 50 毫摩尔 MES 缓冲液滴定到 pH 4 至 7.8。将每个缓冲液的150微升移液插入光学底部96孔板的孔中。
将染料以30微摩尔浓度加入充满缓冲的井中，并平衡5分钟。将显微镜阶段加热到 35 摄氏度，并选择与前面描述的比数 pH 成像相同的设置。将 96 孔板放在显微镜阶段，并聚焦在井底。
获取所有缓冲解决方案的绿色和红色通道图像。定期拍摄激光关闭的图像，以校正探测器偏移。在三次迭代中执行校准实验，并导出所有图像作为 TIFF 文件。
将绿色和红色图像存储在单独的文件夹中，并重命名两个包含序号的文件系列。将图像导入专用图像分析软件（如 ImageJ）。在用激光关闭拍摄的图像中，单击分析和直方图以确定平均荧光强度。
通过单击过程、数学和减法从生物膜图像中减去此值。然后将两个图像系列导入 daime，然后通过单击分段、自动分段和自定义阈值对红色通道图像执行基于阈值的分段。设置高于真菌细胞质荧光强度的低阈值，将高阈值设置为真菌细胞壁和细菌的强度以下。
然后通过单击分段和传输对象图层将分段图像系列的对象图层传输到绿色通道图像系列。删除红色和绿色通道系列中的非对象像素。现在，生物膜图像从细菌和真菌细胞中清除，可以导出为TIFF文件。
将图像系列导入 ImageJ，并自行划分红色图像系列。然后将结果乘以原始图像序列。生成的图像系列与原始图像系列相同，但删除所有零强度像素除外。
使用绿色图像系列重复此过程。接下来，使用两个图像系列上的均值滤波器来补偿探测器噪声。将绿色除以红色图像系列，然后生成所有对象像素的绿与红比。
24 小时和 48 小时后，在井板中研制出坚固的跨王国生物膜。围绕真菌催眠和大细胞空间的S.mutans的单细胞和链表明存在大量的基质。使用查找表可视化了细胞外空间中的 pH 值。
在接触葡萄糖后头五分钟内，生物膜中的细胞外pHH迅速下降。此后，酸化速度减慢，通常在15分钟后达到5.5至5.8的值。由于局部pH的变化，生物膜中的荧光强度随时间而变化。
在图像分割过程中，选择高阈值和低阈值以充分消除细菌和真菌细胞覆盖的所有区域。蓝色和绿色区域分别被低阈值和高阈值消除。仔细选择图像采集参数对于在细菌细胞、真菌细胞和生物膜基质之间获得良好的对比度至关重要。
如果跨王国生物膜生长在流动细胞中，pH的发展可以在流动条件下监测，模仿口腔中的细胞。pH 比率测量已用于识别牙齿生物膜中pH值特别低的局部区域，即所谓的酸性热点。
