このプロトコルは、ストレプトコッキュースからなるクロス王国バイオフィルムの培養のための簡単に実行できる方法を提示する。ミュータンとカンディダ・アルビカンス。その後の共焦点顕微鏡ベースのpHレシオメトリーは、これらのバイオフィルムの細胞外マトリックス内のpHの発達を正確に監視することを可能にする。
画像取得パラメータの慎重な選択は、その後の分析のために十分なコントラストを持つ画像データを取得することが最も重要です。pHレシオメトリーは、リアルタイムでクロス王国バイオフィルムの水平および垂直の両方のpH勾配を研究するための迅速、正確、および安価な方法です。pHレシオメトリーは、純粋に真菌および細菌性バイオフィルムで行うこともできます。
バイオフィルムにおける微生物代謝の理解を深める方法です。バイオフィルムの成長の手順を実証することは、私の研究室の技術者であるアネット・アクジャー・トムセンです。好気条件下で摂氏37度で血液寒天プレート上のS.ミュータンとC.アルビカンを成長させます。
その後、各生物の単一のコロニーを脳の心臓注入の5ミリリットルで満たされたチューブを試験し、さらに18時間成長させる。翌日、培養物を1,200回gで5分間遠心し、上清を捨てます。生理食塩水中の細胞を再中断し、C.アルビカンとS.ミュータンの両方のOD 550〜0.5を調整します。
その後、S.mutans懸濁液を1〜10に希釈して、同等の濃度を達成する。ピペット50マイクロリットルの無菌唾液を顕微鏡用の光学底96ウェルプレートの井戸に入れた。30分間、37°Cでプレートをインキュベートし、滅菌生理食塩水100マイクロリットルでプレートを3回洗浄し、井戸を空にします。
各ウェルに100マイクロリットルのC.albicans懸濁液を加え、37°Cでプレートを90分間インキュベートし、生理食塩水で3回洗浄します。次に、100マイクロリットルの熱不活性化胎児ウシ血清を各ウェルに加えます。プレートを2時間インキュベートし、生理後3回焼き上げた。
井戸を空にするが、過度のせん断力を避けるために20マイクロリットルの貯水池を残します。S.ミュータンスサスペンション100マイクロリットル、BHI150マイクロリットル、5%スクロースを各ウェルに加えます。その後、24時間以上摂氏37度でプレートをインキュベートします。
古いバイオフィルムを栽培する場合は、毎日培地を交換してください。クロス王国成長段階の終わりに、滅菌生理食塩水でプレートを5回洗います。レシオメトリックpHイメージングでは、63X油または水浸水レンズ、543ナノメートルレーザーライン、およびスペクトルイメージングシステムを備えた反転共焦点レーザー走査顕微鏡を使用します。
インキュベーターを使用して、顕微鏡ステージを摂氏35度に温めます。576~608ナノメートルの緑蛍光と629~661ナノメートルの赤色蛍光を同時検出する検出器をセットします。次に、適切なレーザーパワーとゲインを選択して、過度に露出し過ぎないようにします。
ピンホールサイズを1つのエアユニットまたは約0.8マイクロメートルの光学スライスに設定します。次に、画像サイズを 512 x 512 ピクセルに設定し、スキャン速度を 2 に設定します。平均オプションを使用して、2 の行平均を選択します。
0.4%グルコースをpH7に滴定して、100マイクロリットルの無菌生理食塩水を調製します。次に、C-SNARF-4のストック溶液を作り、30マイクロモルの最終濃度に染料を加えます。20マイクロリットルの貯蔵所を残してクロス王国のバイオフィルムと井戸の1つを空にし、グルコースとレシオメトリック色素で生理食塩水を追加します。
プレートを顕微鏡ステージに置き、イメージングを開始します。摂氏35度で0.2 pH単位の増分でpH 4〜7.8に滴定された一連の50ミリモルMESバッファーを準備します。各緩衝液のピペット150マイクロリットルを光学底96ウェルプレートのウェルに入れた。
30マイクロモルの濃度でバッファー充填井戸に染料を加え、5分間平衡させます。顕微鏡ステージを摂氏35度まで温め、先に説明したレシオメトリックpHイメージングと同じ設定を選択します。顕微鏡のステージに96ウェルプレートを置き、井戸の底に焦点を当てます。
すべてのバッファソリューションに対して、緑と赤のチャンネル画像を取得します。一定の間隔で、レーザーをオフにして画像を撮影し、検出器のオフセットを補正します。キャリブレーション実験を三重で実行し、すべての画像をTIFFファイルとしてエクスポートします。
緑と赤の画像を別々のフォルダに保存し、両方のファイルの名前を連番に変更します。ImageJ などの専用の画像解析ソフトウェアに画像をインポートします。レーザーをオフにして撮影した画像では、分析とヒストグラムをクリックして平均蛍光強度を決定します。
プロセス、数学、および減算をクリックして、バイオフィルム画像からこの値を減算します。次に、2 つの画像シリーズを daime にインポートし、セグメント、自動セグメンテーション、およびカスタムしきい値をクリックして、赤チャンネル画像のしきい値ベースのセグメンテーションを実行します。真菌細胞質の蛍光強度を上回る低い閾値と、真菌細胞壁および細菌の強度を下回る高い閾値を設定します。
次に、セグメント化された画像系列のオブジェクト層を、セグメントをクリックして緑色のチャンネル画像シリーズに転送し、オブジェクトレイヤーを転送します。赤と緑のチャンネルシリーズの非オブジェクトピクセルを削除します。バイオフィルム画像は細菌や真菌細胞から消去され、TIFFファイルとしてエクスポートできるようになりました。
ImageJ にイメージ シリーズをインポートし、赤いイメージシリーズを単独で分割します。次に、結果に元の画像系列を掛けます。結果の画像シリーズは、ゼロの輝度ピクセルがすべて削除される点を除いて、元の画像系列と同じです。
緑の画像シリーズでプロセスを繰り返します。次に、両方の画像系列の平均フィルタを使用して、検出器のノイズを補正します。緑を赤い画像系列で割り、すべてのオブジェクト ピクセルに対して緑と赤の比率を設定します。
24時間と48時間後にウェルプレートで開発された堅牢なクロス王国バイオフィルム。真菌性ヒphphaeと大きな細胞内空間の周囲にグループ化されたS.mutansの単一細胞および鎖は、体積的なマトリックスの存在を示した。細胞外空間内のpHをルックアップテーブルを用いて可視化した。
バイオフィルム中の細胞外pHは、グルコースにさらされた後の最初の5分間で急速に低下した。その後、酸性化は15分後に典型的に5.5〜5.8の値に達して減速した。局所的なpH変化により、バイオフィルムの蛍光強度は時間の経過とともに変化した。
画像のセグメンテーション中に、細菌および真菌細胞で覆われたすべての領域を適切に排除するために、高い閾値と低い閾値が選択されました。青と緑の領域は、それぞれ低いしきい値と高い閾値によって排除されました。画像取得パラメータの慎重な選択は、細菌細胞、真菌細胞、およびバイオフィルムマトリックスの間の良好なコントラストを得るために重要です。
クロス王国バイオフィルムがフローセルで成長すれば、pHの発達は口腔内のものを模倣した流れ条件下で監視することができる。pHレシオメトリーは、特に低pH、いわゆる酸性化ホットスポットを有する歯科バイオフィルムの局所領域を同定するために採用されている。
