O protocolo apresenta um método fácil de executar para o cultivo de biofilmes entre reinos que consistem em StreptococcuS. mutans e Candida albicans. A proporção de pH baseada em microscopia confocal permite um monitoramento preciso dos desenvolvimentos de pH dentro da matriz extracelular desses biofilmes.
A escolha cuidadosa dos parâmetros de aquisição de imagens é de extrema importância para obter dados de imagem com contraste suficiente para análise posterior. a proporção de pH é um método rápido, preciso e barato para estudar gradientes de pH horizontais e verticais em biofilmes entre reinos em tempo real. a proporção de pH também pode ser realizada em biofilmes puramente fúnicos e bacterianos.
O método contribui para aumentar nossa compreensão do metabolismo microbiano em biofilmes. Demonstrando o procedimento para o crescimento do biofilme estará Anette Aakjaer Thomsen, técnica do meu laboratório. Cresça S.mutans e C.albicans em placas de ágar de sangue a 37 graus Celsius em condições aeróbicas.
Em seguida, transfira colônias únicas de cada organismo para testar tubos cheios de cinco mililitros de infusão cerebral e cultivá-los por mais 18 horas. No dia seguinte, centrifugar as culturas a 1.200 vezes g por cinco minutos e descartar o supernaspe. Resuspend as células em soro fisiológico e ajuste o OD 550 para 0,5 tanto para C.albicans quanto S.mutans.
Em seguida, diluir a suspensão S.mutans de 1 a 10 para alcançar concentrações equivalentes. Pipeta 50 microliters de solução salivar estéril nos poços de uma placa óptica de fundo 96-well para microscopia. Incubar a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius, depois lave a placa três vezes com 100 microliters de soro fisiológico estéril e esvazie os poços.
Adicione 100 microliters de suspensão de C.albicans a cada poço, incubar a placa a 37 graus Celsius por 90 minutos e depois lavar o poço três vezes com soro fisiológico. Em seguida, adicione 100 microliters de soro bovino fetal inativado pelo calor a cada poço. Incubar a placa por duas horas e depois lavá-la três vezes com soro fisiológico.
Esvazie os poços, mas deixe um reservatório de 20 microliteres para evitar forças excessivas de tesoura. Adicione 100 microliters de suspensão S.mutans e 150 microliters de BHI com 5% de sacarose para cada poço. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por 24 horas ou mais.
Ao cultivar biofilmes mais antigos, substitua o meio diariamente. No final da fase de crescimento entre reinos, lave a placa cinco vezes com soro fisiológico estéril. Para imagens de pH racionamento, use um microscópio de varredura a laser confocal invertido com uma lente de imersão de óleo ou água 63X, uma linha laser de 543 nanômetros e um sistema de imagem espectral.
Use uma incubadora para aquecer o estágio do microscópio a 35 graus Celsius. Defina o detector para detecção simultânea de fluorescência verde de 576 a 608 nanômetros e fluorescência vermelha de 629 a 661 nanômetros. Em seguida, escolha um poder laser apropriado e ganhe para evitar mais e a subexposição.
Ajuste o tamanho do orifício em uma unidade de ar ou uma fatia óptica de cerca de 0,8 micrômetros. Em seguida, defina o tamanho da imagem para 512 por 512 pixels e a velocidade de varredura para dois. Escolha uma média de linha de dois usando a opção média.
Prepare 100 microliters de soro fisiológico estéril com 0,4% de glicose titulada ao pH sete. Em seguida, faça uma solução de estoque de C-SNARF-4 e adicione o corante a uma concentração final de 30 micromolar. Esvazie um dos poços com o biofilme transversal deixando um reservatório de 20 microliter e adicione o soro fisiológico com glicose e corante ratiométrico.
Coloque a placa no estágio do microscópio e inicie a imagem. Prepare uma série de 50 milimões de tampão MES titulados para pH de quatro a 7,8 nos incrementos de 0,2 unidades de pH a 35 graus Celsius. Pipeta 150 microliters de cada solução tampão nos poços de uma placa de fundo óptico de 96 poços.
Adicione o corante aos poços cheios de tampão a uma concentração de 30 micromolares e deixe equilibrar por cinco minutos. Aqueça o estágio do microscópio a 35 graus Celsius e escolha as mesmas configurações que as imagens de pH racionmétricas descritas anteriormente. Coloque a placa de 96 poços no estágio do microscópio e foque na parte inferior dos poços.
Adquira imagens de canais verdes e vermelhos para todas as soluções tampão. Em intervalos regulares, tire imagens com o laser desligado para corrigir o deslocamento do detector. Realize o experimento de calibração em triplicate e exporte todas as imagens como arquivos TIFF.
Armazene as imagens verde e vermelha em pastas separadas e renomeie ambas as séries de arquivos com números sequenciais. Importe as imagens em softwares dedicados de análise de imagens, como imageJ. Nas imagens tiradas com o laser desligado, clique em analisar e histograma para determinar a intensidade média da fluorescência.
Subtraia esse valor das imagens do biofilme clicando no processo, na matemática e na subtração. Em seguida, importe as duas séries de imagens em daime e realize uma segmentação baseada em limiar das imagens do canal vermelho clicando no segmento, segmentação automática e limiar personalizado. Defina o limiar baixo acima da intensidade de fluorescência do citoplasma fúngico e o alto limiar abaixo da intensidade das paredes celulares fúngicas e das bactérias.
Em seguida, transfira a camada de objeto da série de imagens segmentadas para a série de imagens do canal verde clicando no segmento e na transferência da camada do objeto. Exclua pixels não-objeto na série de canais vermelho e verde. Agora, as imagens de biofilme são limpas de células bacterianas e fúngicas e podem ser exportadas como arquivos TIFF.
Importe a série de imagens de volta para ImageJ e divida a série de imagens vermelhas por si só. Em seguida, multiplique o resultado pela série de imagens original. A série de imagens resultante é idêntica à original, exceto que todos os pixels de intensidade zero são removidos.
Repita o processo com a série de imagens verdes. Em seguida, use o filtro médio em ambas as séries de imagens para compensar o ruído do detector. Divida o verde pela série de imagens vermelhas que, em seguida, rende a razão verde-vermelho para todos os pixels de objeto.
Biofilmes robustos de cross-kingdom desenvolvidos nas placas do poço após 24 e 48 horas. Células únicas e cadeias de S.mutans agrupadas em torno de hifas fúngicas e grandes espaços intracelulares indicaram a presença de uma matriz volumosa. O pH no espaço extracelular foi visualizado usando uma mesa de busca.
O pH extracelular nos biofilmes caiu rapidamente nos primeiros cinco minutos após a exposição à glicose. Depois disso, a acidificação desacelerou tipicamente atingindo valores de 5,5 a 5,8 após 15 minutos. Devido às mudanças de pH locais, a intensidade da fluorescência nos biofilmes mudou com o tempo.
Durante a segmentação de imagens, foram escolhidos limiares altos e baixos para eliminar adequadamente todas as áreas cobertas por células bacterianas e fúngicas. As áreas azul e verde foram eliminadas pelos limiares baixos e altos, respectivamente. A escolha cuidadosa dos parâmetros de aquisição de imagens é crucial para obter um bom contraste entre células bacterianas, células fúngicas e a matriz de biofilme.
Se os biofilmes entre reinos forem cultivados em células de fluxo, os desenvolvimentos de pH podem ser monitorados sob condição de fluxo imitando aqueles na cavidade oral. a proporção de pH tem sido empregada para identificar áreas locais em biofilmes dentários com pH particularmente baixo, os chamados hotspots acidógênicos.
