הפרוטוקול מציג שיטה קלה לביצוע לטיפוח ביופילמים חוצי ממלכה המורכבים מסטרפטוקוקוס. מוטנים וקנדידה אלביקנים. יחס ה-pH המבוסס על מיקרוסקופיה קונפוקולרית עוקבת מאפשר ניטור מדויק של התפתחויות ה- pH בתוך המטריצה החוץ-תאית של ביופילמים אלה.
הבחירה הקפדנית בפרמטרים של רכישת תמונה היא בעלת חשיבות עליונה להשגת נתוני תמונה עם ניגודיות מספקת לניתוח הבא. יחס pH הוא שיטה מהירה, מדויקת וזול ללמוד מעברי צבע אופקיים ואנכיים של pH בביופילמים חוצי ממלכה בזמן אמת. יחס pH יכול להתבצע גם ביופילמים פטרייתיים ובקטריאליים גרין.
השיטה תורמת להגברת ההבנה שלנו של חילוף החומרים המיקרוביאלי בביופילמים. הפגנת ההליך לצמיחת ביופילם תהיה אנט אקג'אר תומסון, טכנאית מהמעבדה שלי. לגדל S.mutans ו C.albicans על צלחות אגר דם ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אירוביים.
לאחר מכן להעביר מושבות בודדות של כל אורגניזם למבחנות מלאות חמישה מיליליטר של עירוי לב המוח ולגדל אותם במשך 18 שעות נוספות. ביום שלמחר, צנטריפוגה התרבויות ב 1, 200 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. תן שימוש חוזר בתאים במים מלוחים פיזיולוגיים והתאם את ה- OD 550 ל- 0.5 הן עבור C.albicans והן עבור S.mutans.
ואז לדלל את ההשעיה S.mutans אחד עד 10 כדי להשיג ריכוזים שווי ערך. פיפטה 50 מיקרוליטרים של פתרון רוק סטרילי לתוך בארות של צלחת אופטית 96 בארות עבור מיקרוסקופיה. דגירה את הצלחת במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 100 microliters של מלוחים פיזיולוגיים סטריליים ולרוקן את בארות.
מוסיפים 100 מיקרוליטרים של השעיית C.albicans לכל באר, דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הטוב שלוש פעמים עם מלוחים. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של סרום חזיר עוברי ללא חום לכל באר. דגירה הצלחת במשך שעתיים, ולאחר מכן לשטוף אותו שלוש פעמים עם מלוחים.
רוקנו את בארות אך השאירו מאגר של 20 מיקרוליטר כדי להימנע מ לכוחות גזיר מוגזמים. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של השעיית S.mutans ו-150 מיקרוליטרים של BHI עם 5% סוכרוז לכל באר. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות או יותר.
כאשר מטפחים ביופילמים ישנים יותר, מחליפים את המדיום מדי יום. בסוף שלב הצמיחה חוצה הממלכה, לשטוף את הצלחת חמש פעמים עם מלוחים פיזיולוגיים סטריליים. להדמיית pH יחסמטרי, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך עם עדשת טבילת שמן או מים 63X, קו לייזר 543 ננומטר, ומערכת הדמיה ספקטרלית.
השתמש באינקובטור כדי לחמם את שלב המיקרוסקופ ל 35 מעלות צלזיוס. הגדר את הגלאי לגילוי בו זמנית של פלואורסצנטיות ירוקה מ 576 עד 608 ננומטר ו פלואורסצנטיות אדומה מ 629 ל 661 ננומטר. לאחר מכן בחר כוח לייזר מתאים ולהשיג כדי למנוע מעל וחשיפה.
הגדר את גודל חור הסיכה ליחידת אוויר אחת או לפרוסה אופטית של כ- 0.8 מיקרומטר. לאחר מכן הגדר את גודל התמונה ל- 512 על 512 פיקסלים ואת מהירות הסריקה לשניים. בחר ממוצע שורה של שניים באמצעות האפשרות הממוצעת.
הכינו 100 מיקרוליטרים של מלוחים פיזיולוגיים סטריליים עם 0.4% גלוקוז עד pH 7. לאחר מכן לעשות פתרון מלאי של C-SNARF-4 ולהוסיף את הצבע לריכוז הסופי של 30 micromolar. רוקנו את אחת האגם עם הביופילם חוצה הממלכה והשאירו מאגר של 20 מיקרוליטר והוסיפו את תמיסת מלח עם גלוקוז וצבע יחסמטרי.
מניחים את הצלחת על שלב המיקרוסקופ ומתחילים בהדמיה. הכן סדרה של חיץ MES 50 מילימולרי titrated ל pH ארבע עד 7.8 במרווחים של 0.2 יחידות pH ב 35 מעלות צלזיוס. פיפטה 150 מיקרוליטרים של כל פתרון חיץ לתוך בארות של צלחת אופטית 96 בארות.
מוסיפים את הצבע ל בארות מלאות החיץ בריכוז של 30 מיקרומולרים ונותנים לו לצייד במשך חמש דקות. מחממים את שלב המיקרוסקופ ל-35 מעלות צלזיוס ולבחור את אותן הגדרות כמו הדמיית pH יחסמטרי שתוארה קודם לכן. מניחים את צלחת 96 הבאר על שלב המיקרוסקופ ולהתמקד בתחתית הבארות.
רכוש תמונות ערוץ ירוק ואדום עבור כל פתרונות המאגר. במרווחי זמן קבועים, לצלם עם הלייזר כבוי כדי לתקן עבור היסט גלאי. בצע את ניסוי הכיול ב- triplicate וייצא את כל התמונות כקבצי TIFF.
אחסן את התמונות הירוקות והארדומים בתיקיות נפרדות ושנה את שמן של שתי סדרות הקבצים למספרים רציפים. יבא את התמונות לתוכנה ייעודית לניתוח תמונות כגון ImageJ. בתמונות שצולמו עם הלייזר כבוי, לחץ על לנתח היסטוגרמה כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת.
הפחת ערך זה מתמונות הביופילם על-ידי לחיצה על תהליך, מתמטיקה וחיסור. לאחר מכן יבא את שתי סדרות התמונות ל-daime ובצע פילוח מבוסס סף של תמונות הערוץ האדום על-ידי לחיצה על מקטע, פילוח אוטומטי סף מותאם אישית. הגדר את הסף הנמוך מעל עוצמת הפלואורסצנטיות של הציטופלסמה הפטרייתית ואת הסף הגבוה מתחת לעוצמת קירות התא הפטרייתי והחיידקים.
לאחר מכן העבר את שכבת האובייקט של סדרת התמונות המקטעים לסדרת התמונות של הערוץ הירוק בלחיצה על מקטע והעברת שכבת אובייקט. מחק פיקסלים שאינם אובייקטים בסדרת הערוצים האדומה והירוקה. עכשיו תמונות biofilm מנוקים תאים חיידקיים ופטריות ניתן לייצא כמו קבצי TIFF.
יבא את סדרת התמונות בחזרה ל- ImageJ וחלק את סידרת התמונות האדומות בעצמה. לאחר מכן הכפילו את התוצאה בסדרת התמונות המקורית. סדרת התמונות המתקבלת זהה למקור, פרט לכך שכל הפיקסלים בעוצמת אפס יוסרו.
חזור על התהליך באמצעות סידרת התמונות הירוקה. לאחר מכן, השתמש במסנן הממוצע בשתי סדרות התמונות כדי לפצות על רעש גלאי. חלקו את הירוק בסדרת התמונה האדומה המניבה את היחס בין ירוק לאדום לכל פיקסלי האובייקט.
ביופילמים חוצי ממלכה חזקים שפותחו בצלחות באר לאחר 24 ו -48 שעות. תאים בודדים ושרשראות של S.mutans מקובצים סביב hyphae פטרייתי ומרחבים תאיים גדולים הצביעו על נוכחות של מטריצה רחבת ידיים. ה- pH במרחב החוץ-תאי הודמי באמצעות טבלת בדיקת מידע.
ה- pH החוץ-תאי בביופילמים ירד במהירות בחמש הדקות הראשונות לאחר החשיפה לגלוקוז. לאחר מכן, חומציות האטה בדרך כלל להגיע לערכים של 5.5 כדי 5.8 לאחר 15 דקות. בשל שינויי ה- pH המקומיים, עוצמת הפלואורסצנטיות בביופילמים השתנתה עם הזמן.
במהלך פילוח התמונה, נבחרו סף גבוה ונמוך כדי לחסל כראוי את כל האזורים המסוקרים על ידי תאים חיידקיים ופטריות. האזורים הכחולים והירוקים בוטלו על ידי הסף הנמוך וה גבוה בהתאמה. הבחירה הקפדה בפרמטרים של רכישת תמונה חיונית להשגת ניגודיות טובה בין תאי חיידקים, תאים פטרייתיים ומטריצת הביופילם.
אם ביופילמים חוצי ממלכה גדלים בתאי זרימה, ניתן לפקח על פיתוחי pH בתנאי זרימה המחקה את אלה בחלל הפה. pH יחס הועסק כדי לזהות אזורים מקומיים ביופילמים שיניים עם pH נמוך במיוחד, מה שנקרא נקודות חמות חומציות.
