Протокол представляет собой простой в работе метод выращивания кросс-царства биопленки, состоящий из StreptococcuS. мутаны и Кандиды Альбиканы. Последующая конфокалярная микроскопия на основе соотношения рН позволяет точно контролировать развитие рН внутри внеклеточной матрицы этих биопленок.
Тщательный выбор параметров получения изображений имеет первостепенное значение для получения данных изображения с достаточным контрастом для последующего анализа. рН-коэффициентметрия является быстрым, точным и недорогим методом изучения как горизонтальных, так и вертикальных градиентов рН в кросс-царстве биопленки в режиме реального времени. рН-коэффициентометрия также может быть выполнена в чисто грибковых и бактериальных биопленок.
Метод способствует повышению нашего понимания микробного метаболизма в биопленки. Демонстрацией процедуры роста биопленки будет Анетт Аакджаер Томсен, техник из моей лаборатории. Выращиваем С.мутаны и К.альбиканы на агарных пластинах крови при 37 градусах Цельсия в аэробных условиях.
Затем перенесите одиночные колонии каждого организма в пробирки, заполненные пятью миллилитров вливания сердца мозга и выращивайте их еще 18 часов. На следующий день центрифуга культур в 1200 раз г в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Resuspend клетки в физиологическом солевом растворе и отрегулировать OD 550 до 0.5 для обоих C.albicans и S.mutans.
Затем разбавьте подвеску S.mutans от одного до 10 для достижения эквивалентных концентраций. Пипетт 50 микролитров стерильного слюнного раствора в колодцы оптического дна 96-хорошо пластины для микроскопии. Инкубировать пластину в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, затем мыть пластину три раза с 100 микролитров стерильного физиологического солевого раствора и опорожнить колодцы.
Добавить 100 микролитров подвески C.albicans к каждой хорошо, инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение 90 минут, затем мыть хорошо три раза с солевым раствором. Затем добавьте к каждому колодец 100 микролитров тепловой инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода. Инкубировать тарелку в течение двух часов, затем мыть его три раза солевым раствором.
Опустить скважины, но оставить 20 микролитров резервуар, чтобы избежать чрезмерного силы стрижки. Добавьте 100 микролитров подвески S.mutans и 150 микролитров BHI с 5%-ной сахарозой к каждой хорошо. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов или дольше.
При выращивании старых биопленок, заменить средний ежедневно. В конце фазы роста кросс-царства, мыть пластину пять раз стерильным физиологическим солевым раствором. Для обработки соотношения pH используйте перевернутый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с объективом 63X-масла или погружения в воду, лазерной линией 543 нанометров и спектральной системой визуализации.
Используйте инкубатор для нагрева стадии микроскопа до 35 градусов по Цельсию. Установите детектор для одновременного обнаружения зеленой флуоресценции с 576 до 608 нанометров и красной флуоресценции с 629 до 661 нанометров. Затем выберите соответствующую мощность лазера и получить, чтобы избежать чрезмерного и недоэкспонированности.
Установите размер пинхол до одного блока воздуха или оптического ломтика около 0,8 микрометров. Затем установите размер изображения до 512 на 512 пикселей и скорость сканирования до двух. Выберите строку в среднем из двух, используя средний вариант.
Приготовьте 100 микролитров стерильного физиологического солевого раствора с 0,4%глюкозы, титрованной до рН семь. Затем сделайте стоковый раствор C-SNARF-4 и добавьте краситель в окончательную концентрацию 30 микромоляров. Пустая одна из скважин с кросс-царством биопленки оставив 20 микролитров резервуар и добавить солевой раствор с глюкозой и коэффициентометрического красителя.
Поместите пластину на сцену микроскопа и начните визуализацию. Подготовьте серию буфера 50 миллимоляр МЕС, хихикаемого до рН от 4 до 7,8 с шагом в 0,2 рН при 35 градусах Цельсия. Пипетка 150 микролитров каждого буферного раствора в колодцы оптического дна 96-хорошо пластины.
Добавьте краситель в заполненные буфером скважины с концентрацией 30 микромолей и дайте ему уравночные в течение пяти минут. Разогреть стадию микроскопа до 35 градусов по Цельсию и выбрать те же настройки, что и для соотношения параметрических изображений рН ранее описанных. Поместите пластину из 96 скважин на сцену микроскопа и сосредоточьтесь на дне колодцев.
Приобретайте изображения зеленых и красных каналов для всех буферных решений. Через регулярные промежутки времени, принимать изображения с лазером выключен, чтобы исправить для детектора смещения. Выполните эксперимент по калибровке в тройном и экспортировать все изображения в качестве файлов TIFF.
Храните зеленые и красные изображения в отдельных папках и переименуй обе серии файлов с последовательными числами. Импорт изображения в специальное программное обеспечение для анализа изображений, такое как ImageJ. На снимках, сделанных с выключением лазера, щелкните анализ и гистограмму, чтобы определить среднюю интенсивность флуоресценции.
Вычесть это значение из изображений биопленки, нажав на процесс, математику и вычесть. Затем импортировать две серии изображений в дайме и выполнять пороговую сегментацию изображений красного канала, нажав сегмент, автоматическую сегментацию и пользовательский порог. Установите низкий порог выше интенсивности флуоресценции грибковой цитоплазмы и высокий порог ниже интенсивности стенок грибковых клеток и бактерий.
Затем перенесите объектный слой сегментированных изображений в серию изображений зеленого канала, нажав на сегмент и перенесите слой объекта. Удалите неаумные пиксели в серии красных и зеленых каналов. Теперь биопленочные изображения очищены от бактериальных и грибковых клеток и могут быть экспортированы в качестве файлов TIFF.
Импорт серии изображений обратно в ImageJ и разделить красный серии изображений сама по себе. Затем умножьте результат на оригинальную серию изображений. Полученная серия изображений идентична исходной, за исключением удаления всех пикселей нулевой интенсивности.
Повторите этот процесс с помощью серии зеленых изображений. Далее используйте средний фильтр на обеих сериях изображений, чтобы компенсировать шум детектора. Разделите зеленый на ряд красных изображений, который затем дает соотношение зеленого к красному для всех объектов пикселей.
Надежные кросс-царства биопленки разработаны в пластинах хорошо после 24 и 48 часов. Одиночные клетки и цепи S.mutans сгруппированы вокруг грибковых hyphae и больших внутриклеточных пространств указали на наличие объемной матрицы. РН во внеклеточном пространстве визуализировали с помощью таблицы осмотра.
Внеклеточный рН в биопленки быстро упал в первые пять минут после воздействия глюкозы. После этого подкисление замедлилось, как правило, достигнув значений от 5,5 до 5,8 через 15 минут. Из-за локальных изменений рН интенсивность флуоресценции в биопленки со временем менялась.
Во время сегментации изображений были выбраны высокие и низкие пороги для адекватного устранения всех областей, охватываемых бактериальными и грибковыми клетками. Синие и зеленые зоны были ликвидированы низкими и высокими порогами соответственно. Тщательный выбор параметров получения изображения имеет решающее значение для получения хорошего контраста между бактериальными клетками, грибковые клетки, и биопленки матрицы.
Если кросс-царства биопленки выращиваются в клетках потока, рН события могут контролироваться в условиях потока имитирующих те, в полости рта. рН-коэффициентметрия была использована для выявления местных районов в стоматологических биопленок с особенно низким рН, так называемые ацидогенные горячие точки.
