从患者前列腺癌骨转移标本及其异种移植物中提取的三维（3D）有机物的建立与分析

我们描述了建立骨转移性前列腺癌的连续3D患者衍生器官的策略和分步方案。我们优化的协议是实用的，用于直接从患者或患者衍生的异种移植肿瘤组织使用有限的起始材料进行实验的 3D 培养物。该协议的3D器官可以用作外体模型，以了解骨转移性前列腺癌病理学的基本机制和测试治疗。

该协议中的3D器官培养基是特定于前列腺衍生细胞。我们协议的其他部分适用于不同类型的肿瘤组织和转移位点。多明技术可能是这个过程最困难的部分。

实践多明技术将确保有机体、介质和 Matrigel 的圆顶混合物的一致尺寸，并最大限度地减少样品悬浮过程中气泡的形成。视觉演示此方法提供了更好的理解如何处理粘性 Matrigel 成功地培养低密度器官从低数量的细胞。首先将细胞颗粒重新在适当体积的地下室膜中重新吸收，进行 24 孔板设置。

轻柔地向上和向下移液，以确保细胞被重新悬浮，然后移液将适当的细胞悬浮量移入预热组织培养板的中心。倒置板，并立即将它倒置在细胞培养培养箱设置在37摄氏度和5%二氧化碳15分钟。将含有10微摩尔Y-27632二氢氯的适当体积预加热介质放入每个井中。

要从连接的圆形圆顶上形成浮动圆顶，请使用电池刮刀将圆顶从板上拆下。切一块两四英寸的石蜡薄膜，从一毫升塑料移液器尖端盒中放在空尖端架的外壳上。使用戴手套的食指轻轻按下石蜡膜，以追踪注意不要突破膜的神器。

用 70% 乙醇喷洒石蜡膜，并打开细胞培养罩中的 UV 灯，对准备好的薄膜进行至少 30 分钟的消毒。同时，在20微升的地下室膜中重新吸收预处理的细胞。然后移液将悬浮液放入石蜡膜中形成的分管中。

将凝固的珠子和石蜡膜放入六井板和移液器中，将含有10微摩尔Y-27632二氢的预加热介质放入每个井中，同时轻轻刷掉石蜡膜上的珠子。要处理组织学的器官，请从井中去除现有介质，注意不要吸气地下室膜圆顶。加入等量的细胞恢复溶液，在4摄氏度下孵育板60分钟。

孵育后，使用移液器将地下室膜圆顶移出，用移液器尖端压碎。将分离的圆顶和细胞恢复溶液收集到 1.5 毫升管中。在4摄氏度内将管以300倍g离心5分钟，然后取出上一代，放在一边。

保存所有的超级纳，直到最后一步，当器官的存在确认在所需的体积的冷PBS和轻轻地移液器上下机械地移液颗粒，而不会破坏器官。重复离心并去除上经剂。在室温下将颗粒以 4%PFA 的匹配体积固定 60 分钟。

固定后，重复离心步骤和 PBS 洗涤。然后慢慢加入200微升热2%agarose，并立即，但轻轻地从管壁分离细胞颗粒，而不中断它使用25量针连接到一毫升注射器。对于气糖自旋方法，使用 25 量表针添加气糖后，将细胞颗粒从管壁上分离出至关重要。

一旦阿加罗斯完全凝固，用一根毫升注射器上连接25针将其从管子上分离，并将其转移到新的1.5毫升管中。用70%乙醇填充管子，并继续执行传统的组织脱水和石蜡嵌入方案。该协议被成功地用于建立3D器官从患者衍生的异种移植模型的骨转移前列腺癌，以及直接从癌症组织。

器官显示不同的表型，表现为囊肿，球状体，和更高复杂性的器官。从 25 个高分辨率、10 倍放大图像的拼接图像中可以看到整个地下室膜和器官圆顶。为了进一步研究肿瘤组织，对针对基底上皮细胞标记细胞蛋白-5、发光上皮细胞标记细胞蛋白-8和DAPI的五微米厚的器官石蜡部分进行了免疫荧光细胞化学。

该协议可以针对其他应用（如西方印迹、共培养和流式细胞学）进行优化，以探索 3D 器官的特性和药物治疗的效果。这些实验可以单独或结合当前疗法，解决耐药性机制和新型疗法的疗效。该技术的3D器官保留了主体间和主体内异质性，因此是患者疾病的更准确模型。

这项技术为研究人员探索耐药性、肿瘤生成、转移和治疗机制铺平了道路，这些机制可以更预测患者的疾病进展及其对治疗的反应。