骨転移性前立腺癌の連続3D患者由来オルガノイドを確立するための戦略とステップバイステッププロトコルについて述べています。当社の最適化されたプロトコルは、患者または患者由来の異種移植片腫瘍組織から直接限られた出発物質を使用して実験のための3D培養を設定するために実用的です。このプロトコルの3Dオルガノイドは、骨転移性前立腺癌病理の基本的なメカニズムを理解し、治療をテストするためにex vivoモデルとして使用することができます。
このプロトコルの3Dオルガノイド培養培地は、前立腺由来細胞に特異的である。私たちのプロトコルの他の部分は、腫瘍組織および転移部位の異なるタイプに適用可能である。ドミン技術は、このプロセスの中で最も困難な部分であることが証明されるかもしれません。
ドーム型の技術を実践することで、オルガノイド、メディア、マトリゲルのドーム型混合物の一貫したサイズが保証され、サンプル懸濁液中の気泡の形成を最小限に抑えることができます。この方法を視覚的に実証することで、低密度の細胞から低密度オルガノイドをうまく培養するための粘性マトリゲルの扱い方をよりよく理解できます。24ウェルプレートの設定のために、細胞ペレットを適切な量の原膜に再懸濁させることから始めます。
ピペットは、細胞が再懸濁されることを確実にするために穏やかに上下し、その後、細胞懸濁液の適切な体積を、事前に温めた組織培養プレートの中央にピペットします。プレートを反転し、37°Cに設定された細胞培養インキュベーターに逆さまにして、15分間5%の二酸化炭素を置きます。ピペットは、各ウェルに10マイクロモルY-27632ジヒドロクロリドを含む適切な体積の予熱された培地を含む。
付属の円形ドームから浮動ドームを形成するには、セルスクレーパーを使用してプレートからドームを取り外します。パラフィンフィルムを2枚4インチ切り、1ミリリットルのプラスチックピペットチップボックスから空の先端保持ラックのディボットの上に置きます。手袋をした人差し指を使ってパラフィンフィルムを軽く押し下げて、フィルムを突破しないように注意してディボットを追跡します。
パラフィンフィルムに70%エタノールをスプレーし、細胞培養フードのUVランプをオンにして、少なくとも30分間、調製したフィルムを殺菌します。一方、前処理された細胞を20マイクロリットルの地下膜に再懸濁させる。その後、パラフィンフィルムに形成されたディボットに懸濁液をピペットする。
固化ビーズとパラフィンフィルムを6ウェルプレートに入れ、10マイクロモルY-27632ジヒドロクロリドを含むプリウォーム培地を3~5ミリリットルのプリホットル培地に入れ、パラフィンフィルムからビーズを軽くブラッシングします。組織学のためのオルガノイドを処理するには、地下膜ドームを吸引しないように注意して井戸から既存の培地を取り除きます。等量の細胞回収液を加え、プレートを摂氏4度で60分間インキュベートします。
インキュベーション後、ピペットを使用して地下膜ドームを外し、ピペットチップで粉砕します。解ciaされたドームと細胞回収液を1.5ミリリットルチューブに回収します。チューブを摂氏4度で300倍にして5分間遠心し、上清を取り除いて脇に置きます。
オルガノイドの存在が冷たいPBSの所望の容積で確認され、オルガノイドを中断することなくペレットを機械的に取り除くために穏やかにピペットが上下に確認されたとき、最後のステップまですべての上澄み物を保存します。遠心分離を繰り返し、上清を取り除く。ペレットを室温で60分間4%PFAの一致したボリュームに固定します。
固定後、遠心分離工程とPBS洗浄を繰り返します。その後、ゆっくりと暖かい2%アガロースの200マイクロリットルを追加し、すぐに、穏やかに1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージ針を使用してそれを中断することなく、チューブ壁から細胞ペレットを取り外します。アガローススピンダウン法では、25ゲージ針を用いてアガロースを添加した直後に、細胞ペレットをチューブの壁から取り外す必要があります。
アガロースが完全に固まったら、1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針でチューブから取り外し、新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。70%エタノールでチューブを充填し、組織脱水およびパラフィン埋め込みのための従来のプロトコルを進めます。このプロトコルは、骨転移性前立腺癌の患者由来の異種移植片モデルから、また癌組織から直接3Dオルガノイドを確立するために成功した。
オルガノイドは、嚢胞、スフェロイド、およびより複雑なオルガノイドとして現れる異なる表現型を示した。地下膜とオルガノイドのドーム全体が、25の高解像度、10倍の拡大画像からステッチされた画像で見ることができます。さらに腫瘍組織を調査するために、免疫蛍光細胞化学は、基底上皮細胞マーカーサイトケラチン-5、ルミナル上皮細胞マーカーサイトケラチン-8およびDAPIを標的とするオルガノイドの5マイクロメートル厚いパラフィンセクションに対して行った。
このプロトコルは、ウェスタンブロッティング、共培養、フローサイトメトリーなどの他のアプリケーションに最適化して、3Dオルガノイドの特性と薬物治療の効果を探求することができます。これらの実験は、薬剤耐性のメカニズムと、単独で、または現在の治療法と組み合わせて新しい治療法の有効性に対処することができます。この技術の3Dオルガノイドは、対象間および被験体内の異質性を保持し、したがって患者における疾患のより正確なモデルである。
この技術は、研究者が患者の疾患進行と治療への応答をより予測可能にする可能性のある薬剤耐性、腫瘍形成、転移および治療のメカニズムを探求する道を開く。
