Мы описываем стратегии и пошаговое составление протоколов по созданию серийных органоидов, полученных пациентом, органовоидов костного метастатического рака предстательной железы. Наши оптимизированные протоколы практичны для настройки 3D культур для экспериментов с использованием ограниченного исходного материала непосредственно от пациентов или ксенотрансплантатных опухолевых тканей пациента. 3D органоиды из этого протокола могут быть использованы в качестве моделей ex vivo, чтобы понять основные механизмы патологии рака костной метастатической простаты и проверить лечение.
3D органоидной культуры средств массовой информации в этом протоколе специфичен для простаты полученных клеток. Другие части наших протоколов применимы к различным типам опухолевых тканей и метастатических участков. Техника доминга может оказаться самой сложной частью этого процесса.
Практика доминга техника обеспечит последовательный размер куполообразной смеси органоидов, средств массовой информации и Matrigel, и свести к минимуму образование пузырьков во время суспензии образца. Визуально демонстрируя этот метод обеспечивает лучшее понимание того, как обращаться с вязким Matrigel для успешного культивирования органоидов более низкой плотности из низкого количества клеток. Начните с повторного перерасхода гранул клетки в соответствующем объеме мембраны подвала для установки пластины 24-хорошо.
Pipette вверх и вниз мягко, чтобы убедиться, что клетки перерасход, а затем pipette соответствующий объем клеточной подвески в центр предварительно разогретой пластины культуры ткани. Переверните пластину и сразу же поместите ее вверх дном в инкубатор клеточной культуры, установленный на уровне 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 15 минут. Pipette соответствующий объем предварительно разогретой среды, содержащей 10 микромолейных Y-27632 дигидрохлорида в каждой хорошо.
Чтобы сформировать плавучий купол из прикрепленного круглого купола, отсоедините купол от плиты с помощью клеточного скребка. Вырезать два на четыре дюйма кусок парафиновой пленки и поместите его на верхней части divots пустой кончик проведения стойки из одного миллилитров пластиковой пипетки кончик коробки. Используйте указательный палец в перчатках, чтобы мягко нажать на пленку парафина, чтобы проследить divots заботиться, чтобы не прорваться через пленку.
Спрей парафиновой пленки с 70% этанола и включите УФ-лампу в капюшоне культуры клеток, чтобы стерилизовать подготовленную пленку, по крайней мере 30 минут. Между тем, повторное приостановление предварительно обработанных клеток в 20 микролитров мембраны подвала. Затем пипетка подвески в divots формируется в парафиновой пленке.
Поместите затверденные бусы и парафиновую пленку в шести-хорошо пластины и пипетки от трех до пяти миллилитров предварительно разогретой среды, содержащей 10 микромолящих Y-27632 дигидрохлорид в каждый хорошо, а осторожно щеткой бусы от парафиновой пленки. Для обработки органоидов для гистологии, удалить существующие средства массовой информации из хорошо заботиться, чтобы не аспирировать купола мембраны подвала. Добавьте равный объем раствора восстановления клеток и инкубировать пластину в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия.
После инкубации, выбить купол мембраны подвала с помощью пипетки и раздавить его кончиком пипетки. Соберите разобщенный купол и раствор восстановления клеток в 1,5 миллилитровую трубку. Центрифуга трубки в 300 раз г в четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, затем удалить супернатант и отложите его в сторону.
Сохранить все supernatants до последнего шага, когда наличие органоидов подтверждается при желаемом объеме холодного PBS и осторожно пипетки вверх и вниз, чтобы механически выбить гранулы, не нарушая органоидов. Повторите центрифугу и удалите супернатант. Зафиксните гранулы в соответствует объему 4%PFA в течение 60 минут при комнатной температуре.
После фиксации повторите шаг центрифугации и промыть PBS. Затем медленно добавить 200 микролитров теплой 2%agarose и сразу же, но осторожно отделить гранулы клетки от стенки трубки, не нарушая его с помощью 25 калибровочных иглы прилагается к одному миллилитров шприц. Для агарозы спина вниз метод, очень важно, чтобы отделить гранулы клетки от стенки трубки сразу после добавления агарозы с помощью 25 калибровочных иглы.
После того, как агароза полностью затвердела, отсоедините ее от трубки с 25 калибровочных игл, прикрепленных к одному миллилитровому шприцу, и перенесите его в новую 1,5 миллилитровую трубку. Заполните трубку 70%этанола и приступить к обычному протоколу для обезвоживания тканей и парафина встраивания. Этот протокол был успешно использован для создания 3D органоидов из пациентов полученных ксенотрансплантатов модели рака костной метастатической простаты, а также непосредственно из ткани рака.
Органоиды отображаются различные фенотипы, которые проявляются как кисты, сфероиды, и более высокая сложность органоидов. Целый купол мембраны подвала и органоидов можно увидеть на сшитом изображении с 25 изображений высокого разрешения, 10X увеличения. Для дальнейшего исследования опухолевой ткани иммунофлюоресцентная цитохимия была выполнена на пятиметровом парафиновом участке органоидов, нацеленных на базальный эпителиальный клеточный маркер цитокератин-5, люминесцентный эпителиальный клеточный маркер цитокератин-8 и ДАПИ.
Этот протокол может быть оптимизирован для других приложений, таких как западные blotting, совместной культуры и потока цитометрии для изучения характеристик 3D органоидов и эффекты лечения наркотиков. Эти эксперименты могли бы решить механизмы лекарственной устойчивости и эффективности новых терапевтических самостоятельно или в сочетании с текущей терапии. 3D органоиды из этого метода сохраняют междометную и внутридомовую неоднородность и поэтому являются более точной моделью заболевания у пациентов.
Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы исследовать механизмы лекарственной устойчивости, туморигенез, метастазы и терапии, которые могут быть более предсказуемыми прогрессирования заболевания у пациентов и их ответ на терапию.
