우리는 뼈 전이성 전립선암의 직렬 3D 환자 파생 오르가노이드를 확립하기 위한 전략및 단계별 프로토콜을 기술합니다. 당사의 최적화된 프로토콜은 환자 또는 환자 유래 xenograft 종양 조직에서 직접 제한된 시작 물질을 사용하여 실험을 위한 3D 배양을 설정하는 것이 실용적입니다. 이 프로토콜에서 3D 오르간로이드는 뼈 전이성 전립선 암 병리학의 기본 메커니즘을 이해하고 치료를 테스트하기 위해 ex vivo 모델로 사용될 수 있습니다.
이 프로토콜의 3D 오르간구배기 배지는 전립선 유래 세포에 특이적이다. 우리의 프로토콜의 그밖 부분은 종양 조직 및 전이성 사이트의 다른 모형에 적용됩니다. 도밍 기술은 이 과정에서 가장 어려운 부분일 수 있습니다.
도밍 기술을 연습하면 오르가노이드, 미디어 및 마모젤의 돔 혼합물의 일관된 크기를 보장하고 샘플 서스펜션 동안 거품 형성을 최소화합니다. 시각적으로이 방법을 시연하는 것은 성공적으로 세포의 낮은 수에서 낮은 밀도 오르가노이드를 배양하기 위한 점성 마트리겔을 처리하는 방법의 더 나은 이해를 제공합니다. 24웰 플레이트 설정을 위해 지하 멤브레인의 적절한 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단하여 시작합니다.
피펫은 세포가 다시 중단되도록 부드럽게 위아래로, 다음 사전 따뜻하게 조직 배양 플레이트의 중심으로 세포 현탁액의 적절한 볼륨을 피펫. 플레이트를 반전시키고 즉시 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 세포 배양 배양에 거꾸로 놓습니다. 피펫은 각각의 우물에 10 마이크로몰러 Y-27632 디하이드로염화물을 포함하는 미리 데워진 배지의 적절한 부피이다.
연결된 둥근 돔에서 부동 돔을 형성하려면 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 돔을 분리합니다. 파라핀 필름을 2x 4인치 자르고 1밀리리터 플라스틱 파이펫 팁 박스에서 선반을 들고 있는 빈 팁의 디봇 위에 놓습니다. 장갑을 낀 검지 손가락을 사용하여 파라핀 필름을 부드럽게 눌러 영화를 돌파하지 않도록 주의를 기울이는 디봇을 추적합니다.
파라핀 필름을 70% 에탄올로 분무하고 세포 배양 후드의 UV 램프를 켜서 준비된 필름을 30분 이상 살균한다. 한편, 지하 막의 20 마이크로 리터에서 미리 처리 된 세포를 다시 중단. 그런 다음 파라핀 필름에 형성된 디봇으로 서스펜션을 피펫합니다.
고체 구슬과 파라핀 필름을 6웰 플레이트에 넣고 파라핀 필름에서 구슬을 부드럽게 닦으면서 10개의 마이크로몰러 Y-27632 디하이드로클로라이드를 각각 양호에 담아 온전한 매체의 파이펫 3~5밀리리터를 넣습니다. 조직학에 대한 오르가노이드를 처리하려면 지하 멤브레인 돔을 흡인하지 않도록주의하는 우물에서 기존 미디어를 제거하십시오. 동일한 양의 세포 회수 용액을 추가하고 섭씨 4도에서 60 분 동안 플레이트를 배양하십시오.
인큐베이션 후 파이펫을 사용하여 지하 멤브레인 돔을 빼내고 파이펫 끝으로 분쇄합니다. 해리된 돔과 세포 회수 용액을 1.5 밀리리터 튜브로 수집합니다. 5 분 동안 섭씨 4도에서 300 배 g에서 튜브를 원심 분리 한 다음 상체를 제거하고 따로 둡니다.
오르가노이드의 존재가 차가운 PBS의 원하는 부피에서 확인될 때까지 모든 초월제를 저장하고 부드럽게 피펫 위아래로 오르가노이드를 방해하지 않고 펠릿을 기계적으로 제거합니다. 원심분리를 반복하고 상체를 제거합니다. 펠릿을 4%PFA의 일치하는 부피로 실온에서 60분 동안 수정합니다.
고정 후 원심분리 단계와 PBS 세척을 반복합니다. 그런 다음 천천히 200 마이크로 리터의 따뜻한 2 % 아가로즈를 추가하고 즉시 하지만 부드럽게 1 밀리리터 주사기에 부착 된 25 게이지 바늘을 사용하여 방해하지 않고 튜브 벽에서 세포 펠릿을 분리. 아가로즈 스핀 다운 방법의 경우, 25 게이지 바늘을 사용하여 아가로즈를 첨가한 직후 튜브의 벽에서 세포 펠릿을 분리하는 것이 중요합니다.
아가로즈가 완전히 굳어지면, 1밀리리터 주사기에 부착된 25 게이지 바늘로 튜브에서 분리하여 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 70%에탄올로 채우고 조직 탈수 및 파라핀 포함을 위한 기존의 프로토콜을 진행한다. 이 프로토콜은 성공적으로 암 조직에서 직접뿐만 아니라 뼈 전이성 전립선암의 환자 파생 된 xenograft 모델에서 3D 오르가노이드를 확립하는 데 사용되었다.
오르가노이드는 낭종, 스페로이드 및 더 높은 복잡성 오르간노이드로 나타나는 다른 표현형을 표시했습니다. 지하 멤브레인과 오르가노이드의 전체 돔은 25 개의 고해상도 10 배율 이미지에서 스티치 된 이미지에서 볼 수 있습니다. 종양 조직을 더욱 조사하기 위해, 면역형광 세포화학은 기저 상피 세포 마커 시토케라틴-5, 발광 상피 세포 마커 시토케라틴-8 및 DAPI를 대상으로 하는 오르가노이드의 5마이크로미터 두께의 파라핀 섹션에서 수행되었다.
이 프로토콜은 3D 오르가노이드의 특성과 약물 치료의 효과를 탐구하기 위해 서양 블로팅, 공동 배양 및 유동 세포측정과 같은 다른 응용 분야에 최적화 될 수 있습니다. 이 실험은 약물 저항의 기계장치 및 새로운 치료의 효험을 단독으로 또는 현재 치료와 조합하여 해결할 수 있었습니다. 이 기술의 3D 오르간노이드는 주제 간 및 주제 내 이질성을 유지하므로 환자에서 질병의 보다 정확한 모델입니다.
이 기술은 연구원이 환자에서 질병 진행과 치료에 대한 반응의 더 예측 가능 할 수있는 약물 내성, 종양 발생, 전이 및 치료의 메커니즘을 탐구하는 방법을 포장합니다.
