测定细菌和化学物质对开牛结不二病的肠道渗透性的影响

该方法将有助于与肠道微生物群与肠道健康相互作用相关的基本生物学研究。此外，此协议可用于筛选潜在的益生菌和营养素，以治疗肠道健康问题，如肠道漏位综合征和炎症性肠道疾病。该协议使用高通量成像系统，能够快速、精确地定量分析使用各种细菌和化学品处理的C.elegans肠道渗透性。

我们建议不熟悉此技术的科学家限制样品数量，以避免错误标记和其他错误。此过程包括许多需要可视化演示的步骤，例如将蠕虫转移到 96 孔板和使用 Operetta 机器以及和谐软件。首先准备500毫升无菌LB介质。

将单一的P.aeruginosa菌群接种到培养基中，并在37摄氏度下孵育14至15小时，同时在150转/小时摇晃。第二天，均匀地将细菌培养分成两个500毫升的管子，在3，220倍的g和4摄氏度下离心30分钟。取出上一液，在每个管中留下25毫升，总剩余体积为50毫升，然后重新暂停细菌颗粒。

将细菌培养在四摄氏度，直到准备好使用。为了测试细菌对C.elegans肠道渗透性的影响，从冰箱中取出培养物，彻底涡旋。在每个新鲜的NGM板中总共加入800微升，让板在20摄氏度的培养箱中一夜之间干燥。

要准备 DIM 板，将 50 毫升 NGM agar 介质加入一瓶含有 NGM 汤的 DIM 中，然后彻底混合。然后，将20毫升的培养皿倒入每一个90-15毫米的培养皿中。通过将含有NGM介质的20毫升DMSO培养皿添加到每个培养皿中，准备DMSO板，并在室温下将板保持至少3小时以凝固。

将800微升的涡流大肠杆菌或P.aeruginosa培养物传播到每个新鲜的NGM板上，让这些板在20摄氏度的培养箱中一夜之间干燥。用S缓冲液清洗年龄同步的L4幼虫，将大约500种蠕虫转移到含有不同细菌和化学物质的NGM板。然后，在20摄氏度下孵育板48小时。

通过将两毫升热灭活大肠杆菌与四毫克 FITC-dextran 混合，准备 FITC-dextran 补充板。将混合物的100微升添加到20个新鲜的NGM阿加子板中，让板在干净的实验室长椅上干燥一小时。经过48小时的处理，用S缓冲液清洗蠕虫，将它们转移到菲特克-德克斯特兰补充板和没有 FITC-dextran 的NGM板，并孵育板过夜。

第二天，用S缓冲液清洗蠕虫，让它们在新鲜的NGM阿加子板中爬行一小时。在黑色96井平底板的每个井中加入50微升4%甲醛，并将大约50个蠕虫转移到每一个井中。一到两分钟后，去除所有甲醛，并在每个孔中加入100微升安装介质。

甲醛是一种有毒化学物质，应谨慎处理。要捕获荧光图像，请按成像软件中的"打开盖"图标，然后将板插入机器中。单击"设置"，选择板类型，然后添加亮场和 EGFP 通道。

要调整布局，请转到"布局"选择，然后选择"轨道"。将第一张图片设置为 1 微米，将平面数设置为 10，将距离设置为 1 微米。选择一个处理井和一个捕获字段，然后按"运行实验"部分中的"测试"。

如果图像令人满意，请返回到"设置"部分，然后按"重置"图标。然后，选择所有目标井和适当数量的捕获字段。转到"运行实验"，输入板名称，然后按"开始"。

要测量荧光强度，请转到图像分析部分，输入图像，通过选择 EGFP 通道和方法 B 找到单元格。按"应用"图标保存设置。通过进入"评估"部分并调整读出参数，然后开始评估，获取热图和数据表。

与其他两种细菌菌株相比，C.elegans在与P.aeruginosa的孵育后，FITC-dextran荧光显著增加，表明P.aeruginosa对上皮肠道屏障造成了更重大的损害，增加了肠道渗透性。活的和热灭的P.aeruginosa触发了对C.elegans肠道渗透性非常不同的影响。在热灭活时，荧光图像和统计数据都表明P.aeruginosa没有对线虫产生任何毒性。

与 DIM 的 48 小时联合治疗显著降低了暴露在 P.aeruginosa 中的蠕虫肠道内的 FITC-dextran 荧光强度，这表明 DIM 可被视为治疗细菌感染引起的肠道渗透性功能障碍的一个很好的天然产品。重要的是要记住，在准备 FITC-dextran 涂层板时，您需要尽量减少光照射，因为 FITC-dextran 的光敏性。该技术可用于通过测试细菌及其化学成分来确定肠道细菌及其活性成分的致病菌和益生菌作用。