Este método será útil para estudos biológicos básicos relacionados à interação entre microbiota intestinal e saúde intestinal. Além disso, esse protocolo pode ser usado para triagem de potenciais probióticos e nutracêuticos para curar problemas de saúde intestinal, como síndrome do intestino vazado e doenças inflamatórias intestinais. Este protocolo usa um sistema de imagem de alto rendimento para permitir uma análise quantitativa rápida e precisa da permeabilidade intestinal em C.elegans tratados com várias bactérias e produtos químicos.
Recomendamos que um cientista que não esteja familiarizado com essa técnica limite o número de amostras para evitar erros e outros erros. Este procedimento consiste em muitas etapas que requerem demonstração visual, como transferir worms para placas de 96 poços e usar a máquina Operetta, bem como o software Harmony. Comece preparando 500 mililitros de meio LB estéril.
Inocular uma única colônia de P.aeruginosa no meio, e incubar a cultura por 14 a 15 horas a 37 graus Celsius enquanto treme a 150 rpm. No dia seguinte, distribua uniformemente a cultura bacteriana em dois tubos de 500 mililitros, e centrifuá-los a 3.220 vezes g e quatro graus Celsius por 30 minutos. Remova o supernasce, deixando 25 mililitros em cada tubo, para um volume total restante de 50 mililitros, em seguida, resuspende a pelota bacteriana.
Armazene a cultura bacteriana a quatro graus Celsius até estar pronto para uso. Para testar os efeitos das bactérias na permeabilidade intestinal dos C.elegans, remova as culturas da geladeira e alento-as completamente. Adicione um total de 800 microliters a cada placa NGM fresca, e deixe as placas secarem em uma incubadora Celsius de 20 graus durante a noite.
Para preparar as placas DIM, adicione 50 mililitros de ngm médio em uma garrafa de DIM contendo caldo NGM, e misture bem. Em seguida, despeje 20 mililitros do meio em cada placa de Petri de 90 por 15 milímetros. Prepare as placas de DMSO adicionando 20 mililitros de DMSO contendo meio NGM a cada placa de Petri, e deixe as placas em temperatura ambiente por pelo menos três horas para solidificar.
Espalhe 800 microliters de cultura E.coli ou P.aeruginosa em cada placa NGM fresca, e permita que as placas sequem em uma incubadora Celsius de 20 graus durante a noite. Lave as larvas L4 sincronizadas por idade com tampão S e transfira aproximadamente 500 vermes para as placas de NGM contendo diferentes bactérias e produtos químicos. Em seguida, incubar as placas a 20 graus Celsius por 48 horas.
Prepare as placas complementadas pelo FITC-dextran misturando dois mililitros de E.coli inativados a calor com quatro miligramas de FITC-dextran. Adicione 100 microliters da mistura a cada uma das 20 placas frescas de ágar NGM, e deixe as placas secarem por uma hora em um banco de laboratório limpo. Após 48 horas de tratamento, lave os vermes com tampão S, transfira-os para placas complementadas pelo FITC-dextran e para placas de NGM sem FITC-dextran, e incubar as placas durante a noite.
No dia seguinte, lave os vermes com tampão S, e deixe-os rastejar na placa de ágar NGM fresco por uma hora. Adicione 50 microliters de 4% de formaldeído a cada poço de uma placa preta, de 96 poços, de fundo plano, e transfira aproximadamente 50 vermes para cada poço. Após um a dois minutos, remova todo o formaldeído e adicione 100 microliters de meio de montagem em cada poço.
Formaldeído é um químico tóxico e deve ser tratado com cuidado. Para capturar imagens fluorescentes, pressione o ícone Open Lid dentro do software de imagem e insira a placa na máquina. Clique em Configurar, selecione o tipo de placa e adicione os canais brightfield e EGFP.
Para ajustar o layout, vá para a seleção Layout e selecione Acompanhar. Coloque a primeira imagem em um micrômetro, número de planos para 10, e a distância para um micrômetro. Selecione um dos poços de tratamento e um campo de captura e pressione teste na seção Executar experimentos.
Se as imagens forem satisfatórias, retorne à seção Configuração e pressione o ícone Redefinir. Em seguida, selecione todos os poços alvo e um número adequado de campos de captura. Vá para Executar experimento, digite o nome da placa e pressione Iniciar.
Para medir a intensidade da fluorescência, vá até a seção Análise de Imagens, insira a imagem e encontre a célula escolhendo o canal EGFP e o método B.Ajuste os parâmetros de acordo com as instruções do manuscrito e escolha a média como a saída. Pressione o ícone Aplicar para salvar a configuração. Obtenha um mapa de calor e uma tabela de dados indo até a seção Avaliação e ajuste o parâmetro de leitura e, em seguida, inicie a avaliação.
C.elegans mostrou um aumento significativo na fluorescência FITC-dextran após a incubação com P.aeruginosa em comparação com as outras duas cepas bacterianas, indicando que a P.aeruginosa causou danos mais vitais à barreira intestinal epitelial e aumento da permeabilidade intestinal. P.aeruginosa ativada ao vivo e inativado pelo calor desencadeou efeitos muito diferentes na permeabilidade intestinal em C.elegans. Após a inativação do calor, tanto as imagens de fluorescência quanto os dados estatísticos indicam que p.aeruginosa não desencadeou nenhuma toxicidade aos nematoides.
Um co-tratamento de 48 horas com DIM diminuiu significativamente a intensidade de fluorescência fitc-dextran dentro das entranhas de vermes expostos à P.aeruginosa, o que demonstra que o DIM pode ser considerado um bom produto natural para curar disfunção de permeabilidade intestinal causada por infecções bacterianas. É importante lembrar que durante a preparação das placas revestidas fitc-dextran, você precisa minimizar a exposição à luz por causa da sensibilidade à luz do FITC-dextran. Esta técnica pode ser usada para determinar os efeitos patogênicos e probióticos das bactérias intestinais e seus componentes ativos testando as bactérias, bem como sua composição química.
