Diese Methode wird hilfreich für grundlegende biologische Studien im Zusammenhang mit der Interaktion zwischen Darmmikrobiota und Darmgesundheit sein. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für das Screening potenzieller Probiotika und Nutraceuticals verwendet werden, um Darmgesundheitsprobleme zu heilen, wie lecky Darmsyndrom und entzündliche Darmerkrankungen. Dieses Protokoll verwendet ein Bildgebungssystem mit hohem Durchsatz, um eine schnelle und präzise quantitative Analyse der Darmdurchlässigkeit bei C.elegans zu ermöglichen, die mit verschiedenen Bakterien und Chemikalien behandelt werden.
Wir empfehlen einem Wissenschaftler, der mit dieser Technik nicht vertraut ist, die Anzahl der Proben zu begrenzen, um Fehletikettierungen und andere Fehler zu vermeiden. Dieses Verfahren besteht aus vielen Schritten, die eine visuelle Demonstration erfordern, wie z. B. das Übertragen von Würmern auf 96-Well-Platten und die Verwendung der Operettenmaschine sowie der Harmony-Software. Beginnen Sie mit der Zubereitung von 500 Millilitern sterilem LB-Medium.
Impfen Sie eine einzelne Kolonie von P.aeruginosa in das Medium, und bebrüten Die Kultur für 14 bis 15 Stunden bei 37 Grad Celsius, während sie bei 150 U/min schütteln. Am nächsten Tag die Bakterienkultur gleichmäßig in zwei 500-Milliliter-Röhren verteilen und 30 Minuten lang bei 3, 220 mal g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, so dass 25 Milliliter in jeder Röhre, für ein gesamtes verbleibendes Volumen von 50 Milliliter, dann das bakterielle Pellet wieder aussetzen.
Bewahren Sie die Bakterienkultur bei vier Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Um die Auswirkungen von Bakterien auf die Darmdurchlässigkeit von C.elegans zu testen, entfernen Sie die Kulturen aus dem Kühlschrank und wirbeln Sie sie gründlich aus. Fügen Sie insgesamt 800 Mikroliter zu jeder frischen NGM-Platte hinzu und lassen Sie die Platten in einem 20-Grad-Grad-Celsius-Inkubator über Nacht trocknen.
Um DIM-Platten zuzubereiten, 50 Milliliter NGM Agarmedium in eine Flasche DIM mit NGM-Brühe geben und gründlich mischen. Dann 20 Milliliter des Mediums in jede 90 mal 15 Millimeter Petrischale gießen. Bereiten Sie DMSO-Platten vor, indem Sie 20 Milliliter DMSO mit NGM-Medium zu jeder Petrischale hinzufügen, und lassen Sie die Platten mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur, um sie zu erstarren.
800 Mikroliter wirbelnder E.coli- oder P.aeruginosa-Kultur auf jede frische NGM-Platte verteilen und die Platten über Nacht in einem 20-Grad-Grad-Celsius-Inkubator trocknen lassen. Waschen Sie die alterssynchronisierten L4-Larven mit S-Puffer und übertragen Sie etwa 500 Würmer auf die NGM-Platten, die verschiedene Bakterien und Chemikalien enthalten. Dann inkubieren Sie die Platten bei 20 Grad Celsius für 48 Stunden.
Bereiten Sie die FITC-dextran-ergänzten Platten vor, indem Sie zwei Milliliter hitzeinaktiviertes E.coli mit vier Milligramm FITC-Dextran mischen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung zu jeder der 20 frischen NGM AgarPlatten hinzu und lassen Sie die Platten für eine Stunde auf einer sauberen Laborbank trocknen. Nach 48 Stunden Behandlung die Würmer mit S-Puffer waschen, auf FITC-dextran-ergänzte Platten und auf NGM-Platten ohne FITC-Dextran übertragen und die Platten über Nacht inkubieren.
Am nächsten Tag die Würmer mit S-Puffer waschen und eine Stunde lang in der frischen NGM-Agarplatte kriechen lassen. Fügen Sie 50 Mikroliter 4%Formaldehyd in jeden Brunnen einer schwarzen, 96-Well-Flachbodenplatte hinzu und übertragen Sie etwa 50 Würmer in jeden Brunnen. Nach ein bis zwei Minuten das gesamte Formaldehyd entfernen und 100 Mikroliter Montagemedium in jeden Brunnen geben.
Formaldehyd ist eine giftige Chemikalie und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Um fluoreszierende Bilder zu erfassen, drücken Sie das Symbol Deckel öffnen in der Bildverarbeitungssoftware, und legen Sie die Platte in die Maschine ein. Klicken Sie auf Setup, wählen Sie den Plattentyp aus, und fügen Sie die Hellfeld- und EGFP-Kanäle hinzu.
Um das Layout anzupassen, wechseln Sie zur Layoutauswahl, und wählen Sie Spur aus. Legen Sie das erste Bild auf ein Mikrometer, die Anzahl der Ebenen auf 10 und den Abstand auf ein Mikrometer fest. Wählen Sie eine der Behandlungsbohrungen und ein Aufnahmefeld aus, und drücken Sie test en the Run Experiment section.
Wenn die Bilder zufriedenstellend sind, kehren Sie zum Abschnitt Setup zurück, und drücken Sie das Symbol Zurücksetzen. Wählen Sie dann alle Zielbrunnen und eine geeignete Anzahl von Erfassungsfeldern aus. Gehen Sie zu Experiment ausführen, geben Sie den Plattennamen ein, und drücken Sie Start.
Um die Fluoreszenzintensität zu messen, gehen Sie zum Abschnitt Bildanalyse, geben Sie das Bild ein und finden Sie die Zelle, indem Sie den EGFP-Kanal und die Methode B wählen. Passen Sie die Parameter entsprechend den Manuskriptrichtungen an, und wählen Sie den Mittelwert als Ausgabe aus. Drücken Sie das Symbol Anwenden, um das Setup zu speichern. Rufen Sie eine Heatmap und eine Datentabelle ab, indem Sie zum Abschnitt Auswertung gehen, den Ausleseparameter anpassen und dann die Auswertung starten.
C.elegans zeigte eine signifikante Zunahme der FITC-Dextran-Fluoreszenz nach der Inkubation mit P.aeruginosa im Vergleich zu den beiden anderen Bakterienstämmen, was darauf hindeutet, dass P.aeruginosa mehr lebenswichtige Schäden an der epitheliaalen Darmbarriere und erhöhte Darmdurchlässigkeit verursachte. Live und hitzeinaktivierte P.aeruginosa löste sehr unterschiedliche Auswirkungen auf die Darmdurchlässigkeit bei C.elegans aus. Bei der Inaktivierung der Hitze deuten sowohl die Fluoreszenzbilder als auch die statistischen Daten darauf hin, dass P.aeruginosa keine Toxizität für Nematoden auslöste.
Eine 48-stündige Ko-Behandlung mit DIM verringerte signifikant die FITC-Dextran-Fluoreszenzintensität im Darm von Würmern, die P.aeruginosa ausgesetzt sind, was zeigt, dass DIM als ein gutes Natürliches Produkt zur Heilung von Darmdurchlässigkeitsfunktionsstörungen angesehen werden kann, die durch bakterielle Infektionen verursacht werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Sie bei der Herstellung der FITC-dextran-beschichteten Platten die Lichteinstrahlung aufgrund der Lichtempfindlichkeit von FITC-dextran minimieren müssen. Diese Technik kann verwendet werden, um die pathogene und probiotische Wirkung von Darmbakterien und ihre aktiven Komponenten durch die Prüfung der Bakterien zu bestimmen, sowie ihre chemische Zusammensetzung.
